周 博，賈競(jìng)波，李佳銘

薄層色譜法鑒定藍(lán)狐膽汁及其牛磺熊去氧膽酸對(duì)四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用

周 博1，賈競(jìng)波2，李佳銘3

目的 確定藍(lán)狐膽汁的藥理作用。方法 取30只昆明種小鼠，分為5組，每組6只。分別為：(1)空白組，非肝損傷處理，投喂蒸餾水，注射無傷害性的豆油；(2)模型組，肝損傷處理，不投喂任何藥物，完全為四氯化碳(CCL4)急性肝損傷個(gè)體；(3)陽性組，肝損傷處理，投喂護(hù)肝片，0.4 g/kg；(4)高劑量組，肝損傷處理，投喂高劑量藍(lán)狐膽汁粉，10 g/kg；(5)低劑量組，肝損傷處理，投喂低劑量的藍(lán)狐膽汁粉，5 g/kg。首先用TLC法研究藍(lán)狐膽汁成分中是否含有熊膽特有成分——牛磺熊去氧膽酸(UDCA)，其次研究其膽汁對(duì)小鼠CCL4肝損傷是否有保護(hù)作用。結(jié)果 對(duì)比藍(lán)狐膽汁與熊膽汁，兩者的相似度約50%， 兩者共四類物質(zhì)中，有兩類相同，藍(lán)狐膽汁中含有UDCA成分。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝臟被CCL4損傷之后，血清中的AST、ALT濃度明顯增高，模型組與空白組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過藥理結(jié)果及病理切片，可以看到具有抑制CCL4，造成急性肝損傷小鼠AST、ALT濃度降低的作用。結(jié)論 藍(lán)狐膽汁對(duì)損傷的肝細(xì)胞有修復(fù)意義，對(duì)肝臟有明顯的保護(hù)作用。

藍(lán)狐膽汁；谷草轉(zhuǎn)氨酶；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；四氯化碳肝損傷

藍(lán)狐，食肉目(carnivora)犬科(canidae)狐屬(vulpes)的珍貴毛皮動(dòng)物，是人工繁育一個(gè)世紀(jì)后的北極狐(alopex lagopus)后代[1]。藍(lán)狐膽囊在民間具有特有的藥用價(jià)值，《四川中藥志》中提及其膽“風(fēng)干研細(xì)，兌開水服，治心氣痛”[2]。由于考慮藍(lán)狐與熊類親緣關(guān)系近，同為食肉目，其食性相似，投喂飼料的種類相似，因此本研究首先利用薄層色譜法(TLC)，研究藍(lán)狐膽汁成分中是否含有熊膽特有成分——?；切苋パ跄懰?UDCA)；其次考察它對(duì)小鼠CCL4肝損傷是否有保護(hù)作用，旨在確定藍(lán)狐膽汁的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料 藍(lán)狐膽取自黑龍江省綏化狐貍養(yǎng)殖場(chǎng)。將打皮后的藍(lán)狐尸體30只進(jìn)行解剖，取出膽囊，提取膽汁，37 ℃烘干48 h，獲得藍(lán)狐膽汁干粉；取清潔級(jí)昆明種小鼠30只(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，使用許可證：SYXK [浙]2013-0184)，體重18～22 g，雌雄各半。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 TLC分析 熊膽標(biāo)準(zhǔn)品、熊去氧膽酸(UDCA)標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供，薄層層析硅膠(青島海洋化工有限公司)、NaOH溶液、甲苯、鹽酸、氯仿、甲醇、丙酮由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供。TLC分析儀器主要包括：顯微鏡、薄層層析玻璃板、層析缸、玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管、分析天平、容量瓶、蒸發(fā)皿、量杯、烘干箱等。

1.2.2 CCL4肝損傷 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、丙二醛試劑盒、總膽固醇試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供。CCL4分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，D-氨基半乳糖鹽酸鹽(美國Sigma公司)，生理鹽水(浙江藥業(yè)有限公司)，魯花花生油(山東魯花集團(tuán)有限公司)，4%甲醛溶液，70%乙醇，護(hù)肝片、蒸餾水等。實(shí)驗(yàn)中所用兩種致肝損傷藥物為CCL4溶液，豆油稀釋，配比濃度為20%；D-Galn溶液，生理鹽水稀釋，配比濃度為10%?？垢螕p傷藥物兩種，護(hù)肝片(葵花藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20003336)，主要成分包括豬膽粉、柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子和綠豆。藍(lán)狐膽汁粉備用。

實(shí)驗(yàn)儀器包括全自動(dòng)生化分析儀(Glamour2000，法國)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(LeicaRW2235，德國萊卡公司)、分光光度計(jì)(722型，浙江高密儀器廠)、投射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)、光學(xué)顯微鏡(Nikon)、離心機(jī)(浙江高密儀器廠)、水浴鍋(上海醫(yī)用分析儀器廠)、電子勻漿機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、自動(dòng)染色儀(LeicaAutoStainerXL，德國萊卡公司)、酶標(biāo)儀(美國熱電公司)、石蠟包埋機(jī)(LeicaEG1160)、烤箱等。

1.3 方法

1.3.1 TLC分析 (1)樣品制備：取精密測(cè)定藍(lán)狐膽汁粉末50 mg，加8%的NaOH溶液5 ml，120 ℃熱水超聲溶解2 h，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3。再用甲醇超聲提取2次，每次加10 ml，30 min合并提取液，置水浴上蒸發(fā)至干[4]。殘?jiān)蛹状歼m量溶解，移至5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。(2)對(duì)照品制備:取熊膽標(biāo)準(zhǔn)品、UDCA標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，置1 ml量瓶中。加甲醇溶液，備用。(3)試劑配制:將濃度為80%的NaOH加生理鹽水至10 ml，配制成8%的NaOH溶液。將2 ml濃鹽酸加生理鹽水至10 ml，配制成稀鹽酸。將1.25 g磷鉬酸加無水乙醇至25 ml，制成磷鉬酸乙醇。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及CCL4肝損傷處理 取30只昆明種小鼠，分為5組，每組6只。分別為：(1)空白組，非肝損傷處理，投喂蒸餾水，注射無傷害性的豆油；(2)模型組，肝損傷處理，不投喂任何藥物，完全為CCL4急性肝損傷個(gè)體；(3)陽性組，肝損傷處理，投喂護(hù)肝片，0.4 g/kg；(4)高劑量組，肝損傷處理，投喂高劑量藍(lán)狐膽汁粉，10 g/kg；(5)低劑量組，肝損傷處理，投喂低劑量的藍(lán)狐膽汁粉，5 g/kg。

肝損傷處理之前，喂藥物的3組分別灌胃給藥， 1次/d，連續(xù)10 d?？瞻捉M只投喂同體積的蒸餾水。最后一次給藥前16 h，各組做肝損傷處理。在動(dòng)物腹腔注射CCL4豆油溶液，2 ml/kg。空白組只注射同體積的豆油。肝損傷處理后，動(dòng)物禁食禁水。末次給藥后1 h，將動(dòng)物斷頭取血，離心，取血清，測(cè)定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度。

1.3.3 肝組織切片染色方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝組織在4% 甲醛溶液中固定24 h，自來水沖洗6 h，用70% 的乙醇浸泡備用。自動(dòng)脫水機(jī)脫水后，用石蠟包埋機(jī)包埋，制成組織蠟塊，再用切片機(jī)切片，55 ℃烤箱內(nèi)過夜。充分烘干后，用自動(dòng)染色儀水化，HE染色，中性樹膠封片，數(shù)字顯微照相機(jī)觀察肝小葉機(jī)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，做病理學(xué)檢查，并拍攝照片。

2 結(jié) 果

2.1 TLC分析結(jié)果 圖1顯示，藍(lán)狐膽汁中明顯存在3類物質(zhì)(A、B、C)，其遷移值Rf分別為A=9.5，B=8.0，C=6.5。熊膽汁中也存在3類物質(zhì)(E、F、G)，其遷移值Rf分別為E=9.5，F(xiàn)=8.0，G=7.4。對(duì)比藍(lán)狐膽汁與熊膽汁，兩者的相似度約50%，即兩者共四類物質(zhì)中，有兩類相同。使用UDCA標(biāo)準(zhǔn)品所做的TLC圖譜發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)(D)的Rf值為D=8.0，說明藍(lán)狐膽汁與熊膽汁均存在相同的UDCA。

圖1 藍(lán)狐膽汁與熊膽汁TLC圖譜

2.2 藍(lán)狐膽汁對(duì)CCL4肝損傷的影響

2.2.1 對(duì)CCL4肝損傷血清ALT、AST濃度的影響 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝被CCL4損傷后，血清AST、ALT濃度明顯增高(表1)，模型組與空白組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性組(投喂護(hù)肝片的個(gè)體)與模型組之間AST、ALT指標(biāo)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 藍(lán)狐膽汁對(duì)CCL4急性肝損傷血清AST、ALT活力的影響 (n=6；

注：與模型組相比，①P<0.05；與空白組相比，②P<0.05

2.2.2 組織病理切片 (1)空白組：肝結(jié)構(gòu)正常，肝小葉中央靜脈清晰，肝細(xì)胞形態(tài)未見異常，胞漿豐富。嗜酸紅染，胞核染成藍(lán)色，肝竇清晰可見，小葉內(nèi)未見炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(圖2A)。(2)模型組：肝細(xì)胞變性明顯，大量肝細(xì)胞胞漿疏松化，甚至氣球樣變?？梢姼渭?xì)胞點(diǎn)狀壞死，壞死區(qū)有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，標(biāo)志著肝組織已經(jīng)受到損傷(圖2B)。(3)陽性組：肝組織已基本恢復(fù)，但仍可見肝細(xì)胞輕度水腫(圖2C)。(4)高劑量組：肝細(xì)胞仍可見水腫，但未見明顯的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(圖2D)。(5)低劑量組：肝細(xì)胞有明顯水腫，偶見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死(圖2E)。

圖2 正常小鼠與CCL4急性肝損傷小鼠病理(HE,×400)

3 討 論

CCL4作為導(dǎo)致肝損傷的物質(zhì)，其致病機(jī)制比較復(fù)雜，與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等有關(guān)[6]。氧化應(yīng)激反應(yīng)能生成醛類等副產(chǎn)物，如丙二醛MDA等，它們能與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合，最后使細(xì)胞受損。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物是三氯甲基自由基及過氧化三氯甲基自由基，它們能刺激生成Kupffer細(xì)胞，釋放促炎性反應(yīng)因子，使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT溢出，并誘發(fā)結(jié)石。肝損傷時(shí)ALT會(huì)首先進(jìn)入到血液，而當(dāng)線粒體損傷嚴(yán)重時(shí)，AST則大量進(jìn)入血清。如果這兩種物質(zhì)超過正常值的2倍，且持續(xù)2周左右，就可以判斷為肝損傷。本研究結(jié)果表明，CCL4使小鼠血清AST和ALT濃度上升，意味著小鼠肝已經(jīng)受到比較嚴(yán)重的傷害。

本研究結(jié)果表明，藍(lán)狐膽汁對(duì)肝損傷的確具有治療作用。雖然藍(lán)狐膽汁中有多種成分，但游離型膽汁酸UDCA應(yīng)該是藍(lán)狐膽汁的主要藥性成分。因?yàn)樽?961年日本學(xué)者首次證實(shí)UDCA是熊膽中治療肝損傷的藥性物質(zhì)以來[3]，人們多次通過實(shí)踐證明，UDCA類物質(zhì)為治療各種肝損傷的特效藥物[3，4]。本研究采用的護(hù)肝片是陽性臨床復(fù)方中藥，功能主要是疏肝理氣、健脾消食、降低轉(zhuǎn)氨酶(能使AST下降80.67%，使ALT降低70.37%)，被廣泛用于脂肪肝、乙醇肝、藥物性肝損傷、早期肝硬化等癥的治療。值得注意的是，在其藥用成分(熊膽或豬膽粉20 g，柴胡250 g，茵陳250 g，板藍(lán)根250 g，五味子250 g，綠豆128 g)中熊膽粉重量只占1.7%[5]，足見UDCA類物質(zhì)的藥性作用較大。

按照以往建模經(jīng)驗(yàn)[7-10]，小鼠腹腔注射20%～50%濃度的CCL4植物油溶液，并按2 ml/kg的劑量，建模效果是最好的，AST和ALT數(shù)值能成倍增加。注射20%濃度的CCL4組，病理切片出現(xiàn)肝損傷典型現(xiàn)象(肝細(xì)胞明顯疏松化、氣球樣變、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤、點(diǎn)狀或塊狀壞死)；注射50%濃度的CCL4組，病理切片除了經(jīng)典現(xiàn)象，還伴有肝纖維化改變。本研究選用20%濃度建模的結(jié)果是成功的，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求，空白組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病理切片變化明顯。

綜上所述，藍(lán)狐膽汁中含有熊膽有效成分UDCA，無論是高劑量還是低劑量，投喂藍(lán)狐膽汁粉的肝受傷小鼠，血液中的AST、ALT濃度均出現(xiàn)明顯下降，說明藍(lán)狐膽汁具有很強(qiáng)的護(hù)肝作用。

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(2015-03-03收稿 2015-05-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Economy class animal blue fox bile for TLC identification and its protection against CCL4hepatic injury

ZHOU Bo1, JIA Jingbo2, and LI Jiaming3.

1.College of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin 150050,China;2.Traditional Chinese Medicine Resources Development and Utilization, College of Pharmacy Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001,China; 3.Department of Orthopedics the Fifth Hospital in Harbin City of Heilongjiang, Harbin 150051,China

Objective To determine the pharmacological effects of blue fox bile. Method Thirty Kunming mice were divided into 5 groups, each group of six. (1)For the blank group, without the liver damage treatment, was fed on distilled water, and harmless soybean oil was injected. (2) For the model group with liver damage, no drugs were given, were completely CCL4acute liver injury individuals. (3) For positive group with liver damage were fed on liver-protecting, 0.4/kg. (4) For the high dose group with liver damage was fed on high dose of blue fox bile powder, 10 g/kg. (5) For the low dose group with liver damage was fed on the low dose of blue fox bile powder, 5 g/kg. The first study was using TLC method, to determine whether the blue fox bile contained ursodeoxy cholic acid (UDCA). The second study was to determine whether the blue fox bile has a protective effect on CCL4caused hepatic injury in mice. Results The similarity between blue fox bile and bear bile is about 50%, both with two kinds of material, the same in the four kinds of material. Blue fox UDCA component is contained in bile. After experimental animals were inflicted on injury of the liver by CCL4, AST and ALT in serum concentration significantly increased; the difference between the model group and the blank group was statistically significant. Through pharmacological results and pharmacological slices, it can be seen that CCL4caused AST, ALT concentration effect acute liver injury can be inhibited in mice. Conclusions Blue fox bile can repair injury of liver cells and has obvious protective effects on the liver.

blue fox bile; AST; ALT; CCL4liver damage

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531656)

周 博，博士，講師，E-mail：251461104@qq.com

1.150050 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2.150001 哈爾濱，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院；3.150051，哈爾濱市第五醫(yī)院

賈競(jìng)波，E-mail:Jiajingbo2011@163.com

R961.1