肖文林 莊翠竹 時艷 許堯祥 薛令法

青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科；山東省教育廳口腔臨床醫(yī)學(xué)重點實驗室，青島 266555

7-脫氫膽固醇還原酶（7-dehydrocholesterol reductase，Dhcr7）基因突變將導(dǎo)致Dhcr7活性下降，膽固醇水平降低，其前體7脫氫膽甾醇等在體內(nèi)聚集，發(fā)生包括腭裂在內(nèi)的多發(fā)生長和發(fā)育畸形[1]。抑制Dhcr7的活性，可以阻礙膽固醇的代謝，阻斷信號通路而引起一系列缺陷綜合征[2-3]。本課題組發(fā)現(xiàn)，Dhcr7基因在腭突發(fā)育的關(guān)鍵時期有表達，并且表達量隨著腭突的發(fā)育而變化，Dhcr7基因主要表達在腭突間充質(zhì)細胞；進而通過培養(yǎng)腭突間充質(zhì)細胞，篩選出針對Dhcr7的最有效小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）序列[4]。此外，本課題組改進了腭突的取材方法和培養(yǎng)方式，成功進行了腭突的體外器官培養(yǎng)[5]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用體外腭突器官培養(yǎng)技術(shù)，通過腺病毒轉(zhuǎn)染siRNA沉默Dhcr7基因表達，研究Dhcr7基因在腭突融合中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

8～9周的C57BL/6J近交系小鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司）。DIGDNA標(biāo)志和檢測試劑盒（深圳依諾金公司）；人胚腎293T細胞（北京三元基因工程有限公司）；DMΕM/F12（質(zhì)量比1∶1）培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）；siRNA序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2000、二甲基亞砜（Invitrogen公司，美國）；Dhcr7逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物5’-TTTCCTGCTGCTCTTCGCTC-3’和 3’-CTTGGACGCCTCCCACATAA-5’，β-actin引物5’-GAACCCTAAGGCCAACC-3’和3’-TGTCACGCACGATTTCC-5’（上海生工生物有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶、Trizol RNA提取試劑、PrimeScript RT-PCR Kit（日本寶生物工程有限公司）；Dhcr7抗體（Abcam公司，美國）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)志的山羊抗兔和小鼠IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate、濾膜（Millipore公司，美國）；膽固醇（Sigma公司，美國）。包含腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV、骨架質(zhì)粒pAdΕasy-1的腺病毒載體AdΕasy系統(tǒng)AdΕasy Basic Kit（Stratagene公司，美國）。大腸桿菌DH5a由山東省教育廳口腔臨床醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.2 抑制小鼠Dhcr7基因表達的siRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

1.2.1 小鼠Dhcr7基因特異性siRNA位點的選擇及合成 根據(jù)前期實驗篩選的針對C57BL/6J小鼠Dhcr7基因特異性的siRNA位點及陰性對照序列[4]，依據(jù)下列規(guī)則合成針對Dhcr7-siRNA的靶序列：5’-TCGA（SalⅠ酶切位點）+正義-siRNA+GAGTACTG（環(huán)狀結(jié)構(gòu)含SalⅠ酶切位點）+反義-siRNA+TTTTT-3’；5’-CTAG（XbaⅠ酶切位點）+AAAAA+正義-siRNA+CAGTACTC +反義-siRNA-3’。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成Dhcr7-DNA靶序列：正義鏈為5’-TCGACCAACTACGTGTTAGACTTGAGTACTGAAGTGTAACACGTAGMATGGTTTTT-3’，反義鏈為5’-CTAGAAAAACCAACTACGTGTTAGACTTCAGTACTCAAGTGTAACACGTAGMATGG-3’。另設(shè)計一對不針對任何基因的無關(guān)序列作為陰性對照序列，命名為NC序列：正義鏈為5’-TCGATTCTCCGAACGTGTCACGTGAGTACTGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3’，反義鏈為5’’-CTAGAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCAGTACTCACGTGACACGTTCGGAGAA -3’。

1.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建 將設(shè)計的單鏈引物退火形成雙鏈，將其用T4DNA連接酶與內(nèi)切酶SalⅠ、XbaⅠ雙酶切的pAdTrack-CMV回收片段連接構(gòu)建成pAdTrack-CMV-siDhcr7，利用氯化鈣法將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，培養(yǎng)克隆，提取質(zhì)粒。

1.2.3 重組腺病毒載體pAdTrack-CMV-siDhcr7的鑒定 用ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙內(nèi)切酶進行鑒定，分別把pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-NC和經(jīng)ScaⅠ、ΕcoRⅠ酶切的pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-NC片段進行電泳。

1.2.4 重組pAdΕasy-1-siDhcr7的構(gòu)建 因為pAdTrack-CMV載體的多克隆位點前后端全是反復(fù)重復(fù)序列，不能直接測序，所以需將pAdTrack載體用ΕcoRⅠ和ΕcoRⅤ雙酶切后回收進行反向測序。經(jīng)測序顯示，pAdΕasy-CMV-siDhcr7和pAdΕasy-CMV-siNC載體構(gòu)建正確。陽性克隆的pAdTrack-CMV-siDhcr7質(zhì)粒用PmeⅠ酶切線性化以后，以酚-氯仿法抽提、乙醇沉淀后轉(zhuǎn)化帶骨架質(zhì)粒pAdΕasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，體外重組形成pAdΕasy-1-siDhcr7。

1.2.5 重組pAdΕasy-1-siDhcr7的鑒定 重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7質(zhì)粒經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，篩選出抗卡那霉素的重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7質(zhì)粒，然后將其進行PacⅠ酶切，再轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5a大量制備腺病毒質(zhì)粒DNA備用。

1.2.6 重組腺病毒質(zhì)粒在293T細胞中的包裝、擴增及滴度測定 將重組腺病毒質(zhì)粒用 PacⅠ酶切線性化后，用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染293T細胞進行包裝，包裝出具有感染能力的重組腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7，然后進行擴增及滴度測定。

1.3 腭突器官培養(yǎng)及分組

C57BL/6J近交系小鼠于晚8時以雌雄2∶1的比例合籠交配，第2日上午8時檢查雌鼠，有陰道栓者定為妊娠0 d（Ε0）。將Ε13.5的C57BL/6J小鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡1 min。無菌條件下取出胚胎，眼科剪剪下鼠胚頭部，放入無菌的不含鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液（calcium- and magnesium-free phosphate buffer solution，CMF-PBS）中，洗滌3次。應(yīng)用本課題組改進的方法[5]剪取腭突，共30對，分3組（每組10對）分別進行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。分組及培養(yǎng)方法如下。1）正常對照組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養(yǎng)基+腭突；2）空白腺病毒對照組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養(yǎng)基+腭突+空白腺病毒；3）實驗組：不含膽固醇的DMΕM/F12培養(yǎng)基+腭突+Dhcr7 siRNA 腺病毒。

1.4 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SΕM）觀察

取出培養(yǎng)的3組腭突，4%戊二醛固定，冷藏2 h，雙蒸水充分漂洗，PBS再次清洗，分別用體積分數(shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇置換脫水，各浸泡10 min；然后叔丁醇浸泡2 h，于冰箱冷凍室中凍結(jié)，放入ΕD中抽干水分，直到5 Pa左右，鍍膜，SΕM下觀察并采集圖像。

1.5 RT-PCR和Western blot分析

在體視顯微鏡下只剪取腭突部分，分別提取RNA和蛋白進行RT-PCR和Western blot分析。

1.5.1 RT-PCR檢測 以β-actin為內(nèi)參。Dhcr7擴增片段長度為260 bp，擴增條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min。β-actin擴增片段長度為309 bp，擴增條件：94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物電泳：取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，行2%瓊脂糖凝膠電泳，對照相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢測擴增結(jié)果。每個實驗重復(fù)3次。

1.5.2 Western blot分析 在各組樣品中取總蛋白50 μg，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGΕ），轉(zhuǎn)膜，分別孵育Dhcr7抗體、GAPDH內(nèi)參抗體及二抗。經(jīng)曝光、顯影及定影，用Quantity one 4.62軟件（Bio-Rad公司，美國）分析凝膠圖像。每個實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，對RT-PCR和Western blot目標(biāo)帶的灰度值進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，用單因素方差分析進行總體檢驗，有統(tǒng)計學(xué)意義再行LSD法兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抑制小鼠Dhcr7基因表達的siRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

pAdTrack-CMV-siDhcr7、pAdTrack-CMV-siNC質(zhì)粒經(jīng) ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙酶切鑒定后，產(chǎn)生6 350 bp和2 870 bp大小兩個片段，沒經(jīng)酶切的pAdTrack-CMVsiDhcr7和pAdTrack-CMV-siNC片段約為9 220 bp（圖1）；pAdTrack-CMV載體經(jīng)ScaⅠ和ΕcoRⅠ雙酶切后只能使其線性化，相對分子質(zhì)量不發(fā)生變化，說明構(gòu)建重組腺病毒載體成功（圖1）。

圖1 pAdTrack-CMV-siDhcr7和pAdTrack-CMV-siNC質(zhì)粒酶切鑒定圖Fig 1 The enzyme digestion identif ciation of plasmid with pAdTrack-CMV-siDhcr7 and pAdTrack-CMV-siNC

2.2 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

將包裝好的腺病毒pAdΕasy-1-siDhcr7轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后觀察重組腺病毒的表達。腺病毒的表達可通過其綠色熒光蛋白的表達進行檢測（圖2）。培養(yǎng)細胞10～15 d，細胞脫落達80%時收集細胞；在-80及37 ℃環(huán)境下反復(fù)凍溶4次以破碎細胞，收集病毒上清。以病毒上清重復(fù)感染293T細胞，擴增病毒。于96孔細胞培養(yǎng)板中接種293T細胞，培養(yǎng)24 h，按不同的稀釋梯度加入稀釋病毒液，18 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)量。經(jīng)測定，本研究構(gòu)建的病毒滴度為6×1012U·mL-1。

圖2 重組腺病毒載體包裝過程中綠色熒光蛋白的表達 熒光顯微鏡× 100Fig 2 The expression of green color protein in the process of recombinant adenovirus package fluorescent microscope× 100

2.3 Dhcr7 siRNA抑制Dhcr7在培養(yǎng)腭突中的表達

RT-PCR檢測正常對照組、空白腺病毒對照組和實驗組的Dhcr7 mRNA表達量，其結(jié)果見圖3：實驗組Dhcr7 mRNA表達量明顯少于正常對照組和空白腺病毒對照組（P＜0.05）；與正常對照組相比，實驗組Dhcr7 mRNA表達量減少了60.8%。采用Western blot分析Dhcr7蛋白表達量，結(jié)果見圖4：空白腺病毒對照組與正常對照組之間的蛋白表達量相似，而實驗組表達量明顯減少。正常對照組、空白腺病毒對照組和實驗組Dhcr7/GAPDH蛋白灰度值比值分別為0.712±0.097、0.698±0.065、0.267±0.065，正常對照組、空白腺病毒對照組表達量的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），實驗組表達量較正常對照組減少了62.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。該結(jié)果提示Dhcr7 siRNA抑制了Dhcr7在培養(yǎng)腭突中的表達。

圖3 Dhcr7 mRNA在不同組間的表達Fig 3 The mRNA expression of Dhcr7 among different groups

圖4 Dhcr7蛋白在不同組間的表達Fig 4 The protein expression of Dhcr7 among different groups

2.4 Dhcr7在培養(yǎng)腭突中的表達下調(diào)后影響腭突融合

正常對照組和空白腺病毒對照組培養(yǎng)48 h時，兩側(cè)腭突接觸融合（圖5A、B），實驗組兩側(cè)腭突之間有很大的裂隙，可見鼻腔底結(jié)構(gòu)（圖5C），說明Dhcr7基因表達下調(diào)后影響腭突的融合。

圖5 3組腭突的融合情況 SΕMFig 5 The condition of palatal shelves fusion among three groups SΕM

3 討論

Dhcr7基因是膽固醇代謝的關(guān)鍵基因。Dhcr7基因突變引發(fā)的膽固醇代謝失調(diào)將導(dǎo)致Smith-Lemli-Opitz綜合征（Smith-Lemli-Opitz syndrome，SLOS）[6]。SLOS是一種常染色體隱性遺傳性畸形綜合征，特征為膽固醇代謝紊亂，其畸形特征為包括腭裂、前腦無裂等顱面畸形以及肢體缺陷等中線發(fā)育畸形，約50%的患者具有腭裂畸形[7-8]。分子遺傳學(xué)研究表明，SLOS中Dhcr7基因突變除了最常見的IVS8-1G→C，還包括W151X、T93M、R404C及V326L等[9-11]。人類Dhcr7基因定位于11q12～13，因為Dhcr7突變，將導(dǎo)致Dhcr7活性下降，催化膽固醇生物合成出現(xiàn)障礙，使膽固醇水平降低，其前體7-脫氫膽甾醇等在體內(nèi)聚集，從而發(fā)生包括腭裂在內(nèi)的多發(fā)生長和發(fā)育畸形。在SLOS患者[12]和Dhcr7-/-（Dhcr7基因敲除）小鼠模型[13]中，在血漿和組織中都發(fā)現(xiàn)了膽固醇的減少及7-脫氫膽甾醇的增加。因此，推測SLOS的致病基因Dhcr7可能與先天性腭裂的發(fā)生有關(guān)。

本研究前期實驗[4]發(fā)現(xiàn)，Dhcr7在小鼠胚胎腭突發(fā)育的關(guān)鍵時間段表達，并且表達量隨著腭突發(fā)育時間不同而不同，即Dhcr7基因在腭突發(fā)育過程中呈現(xiàn)動態(tài)表達，證實其可能在腭突發(fā)育中起作用。但是Dhcr7在腭突發(fā)育中的作用程度及作用機制仍不明確，本實驗據(jù)此研究Dhcr7表達下調(diào)對腭突發(fā)育融合的影響。

可以抑制內(nèi)源性基因表達的方法較多，其中腺病毒siRNA表達載體轉(zhuǎn)染的方法具有感染效率高、基因沉默效果明顯強于普通質(zhì)粒siRNA表達載體的特點，非常適用于基因功能的研究。腺病毒siRNA表達載體介導(dǎo)的RNA沉默可以根據(jù)實驗的需求在特定的時間點或時間段內(nèi)沉默特定的基因，在細胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)[14-16]中的應(yīng)用已經(jīng)成熟。在本研究中，筆者將前期篩選出的Dhcr7基因沉默最有效siRNA序列構(gòu)建到siRNA重組腺病毒載體，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染入293T細胞，在該細胞中成功地包裝成含Dhcr7 siRNA的腺病毒顆粒后，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入體外培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠腭突中，沉默小鼠腭突Dhcr7基因的表達，與正常對照組及陰性對照組做比較，并利用RT-PCR及Western blot法檢測Dhcr7的表達，結(jié)果顯示：實驗組Dhcr7基因表達比其他兩組明顯減少，與正常對照組相比，實驗組Dhcr7 mRNA表達量減少了60.8%，蛋白表達量減少了62.5%，兩組間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

本研究通過抑制內(nèi)源性Dhcr7基因的表達觀察其對腭突生長和融合的影響，SΕM檢查結(jié)果顯示：Dhcr7基因表達下調(diào)會導(dǎo)致腭突的發(fā)育減緩，兩側(cè)腭突不能順利接觸，腭突不融合；而Dhcr7基因表達正常的正常對照組與陰性對照組腭突融合。這表明Dhcr7基因在腭突發(fā)育融合中起重要作用，其功能障礙將導(dǎo)致DHCR7蛋白表達減少，催化合成內(nèi)源性的膽固醇減少，在缺少外源性膽固醇補充的情況下不能滿足正常腭突發(fā)育的需要，從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。

膽固醇在胚胎發(fā)育的過程中是不可缺少的，然而它在胚胎發(fā)育過程中的作用還不很明確，需要進一步研究其作用機制[17]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，女性及青少年酗酒人數(shù)日趨增多，此外，年輕女性由于追求身材苗條而控制膽固醇的攝入，由此導(dǎo)致的孕期胎兒發(fā)育畸形問題不容忽視。乙醇攝入將影響膽固醇代謝，在孕期將導(dǎo)致胎兒發(fā)生顱面畸形[18]。參與膽固醇代謝的重要基因Dhcr7基因的突變率為3%～4%[19]，孕齡婦女個體具有Dhcr7基因突變的風(fēng)險，若有酗酒習(xí)慣或膽固醇攝入不足時，將加大娩出先天性唇腭裂患兒的風(fēng)險。本研究為此類人群預(yù)防唇腭裂提供了一定的理論支持。

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