王少博,牟心紅，孟 斌，付正英，張引國

鈣調(diào)蛋白和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在大鼠海馬發(fā)育中的變化規(guī)律

王少博1,牟心紅2，孟 斌3，付正英4，張引國5

目的 探討鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin kinaseⅡ, CaMKⅡ)在大鼠海馬發(fā)育中的變化規(guī)律。方法 以出生后第1、7、14、21、30和 50天的大鼠為研究對象, 采用實時定量PCR和Western blot方法分別檢測海馬CaM和CaMKⅡ的mRNA及蛋白的表達。結(jié)果 大鼠海馬CaM及CaMKⅡ在出生后第1天時表達較弱,第14～30天均快速增加(P<0.05或P<0.01),呈增量表達；第50天后表達持續(xù)在高水平(CaMmRNA和CaMKⅡmRNA相對值分別為2.242±0.154和2.418±0.329；CaM蛋白和CaMKⅡ蛋白相對值分別為0.782±0.061和2.194±0.256；P<0.05或P<0.01)，但較出生后第21天已有減弱趨勢。結(jié)論 CaM和CaMKⅡ在海馬中的表達變化具有一定的時序性，此模式可能與突觸的發(fā)育及腦成熟變化密切相關(guān)，也與學(xué)習(xí)記憶功能的形成密切相關(guān)。

鈣調(diào)蛋白；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ；海馬；認知

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，無論是突觸數(shù)目還是神經(jīng)回路的模式都是時刻變化的。與此同時，作為信號傳遞基本單位的突觸，其傳遞效能也不是固定不變的。學(xué)習(xí)和記憶是腦的重要功能，一般認為其神經(jīng)基礎(chǔ)是突觸的可塑性及新神經(jīng)回路的形成。海馬是位于大腦底部邊緣系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶的核心區(qū)域[1]。長時程增強(long term potentiation，LTP)和長時程抑制(long term depression，LTD)是海馬突觸可塑性的兩種主要表現(xiàn)形式。

CaM是廣泛存在于細胞內(nèi)的一種信號系統(tǒng)調(diào)控蛋白，也是細胞內(nèi)最普遍存在的Ca2+感受器。它通過與多種蛋白的相互作用，調(diào)控著突觸小泡的發(fā)生、運輸及再填充，從而傳遞胞內(nèi)Ca2+濃度變化的信號，對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸電生理活動起到至關(guān)重要的調(diào)控作用[2 -5]。

CaMKⅡ位于突觸后致密體(postsynaptic density，PSD)中，為PSD的主要成分之一，在海馬中表達豐富，占腦內(nèi)總蛋白的0.5%～1.0%及海馬蛋白的2%。 CaMKⅡ在神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、骨架蛋白磷酸化、突觸可塑性、基因表達和腦內(nèi)葡萄糖代謝等方面有著重要的生物學(xué)作用，是神經(jīng)信息傳導(dǎo)通路中的重要因子[2 -5]。

本實驗通過研究不同發(fā)育時期大鼠海馬中CaM、CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達量，旨在研究發(fā)育中突觸可塑性的形成，為認知障礙相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與取材 選用成年Wistar大鼠[軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004], 體重270～290 g。雌鼠與雄鼠適應(yīng)3～4 d后，按照3∶1比例合籠。以次晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢發(fā)現(xiàn)精子者確定為妊娠第0天。取孕鼠6只，待分娩后取出生后第1、7、14、21、30、50 天 的仔鼠斷頭處死(從每窩中隨機取 1 只,每組內(nèi)6只鼠)。在冰上取出海馬, 分別用于 RNA 和蛋白質(zhì)的提取。

1.2 主要試劑 CaM兔單克隆抗體(Abcam 公司)、CaMKⅡ兔單克隆抗體(Epitomics公司)、HRP羊抗兔IgG 抗體(Abgent公司)、RNA提取試劑盒 (D9086)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (DRR014A)、DNA Marker (DL500)和SYBR Green試劑盒(RR820A，TaKaRa公司)、瓊脂糖(Spain公司)、PAFR蛋白裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。引物序列見表1。

表1 CaM、 CaMKⅡ 和β-actin基因的引物序列

1.3 Real-time PCR法定量檢測CaM和 CaMKⅡ mRNA水平 根據(jù)Trizol試劑盒說明勻漿海馬組織并提取總RNA；依照反轉(zhuǎn)錄試盒說明書，取 RNA 溶液在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后，以cDNA為模板進行實時定量熒光檢測，結(jié)果采用 2-△△Ct進行分析。PCR引物由北京鼎國昌盛技術(shù)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 Western blot法檢測CaM和CaMKⅡ蛋白的表達 將組織加入含1%蛋白酶抑制藥的1 ml蛋白裂解液中，勻漿后冰上靜置30 min。12000 r/min 4 ℃離心10 min取上清。采用BCA法進行蛋白定量，根據(jù)上樣量計算上樣體積，100 ℃蛋白變性8 min備用。制備12% SDS-PAGE凝膠，微量加樣器順序加樣后電泳至條帶到達目的蛋白相應(yīng)區(qū)域。以電壓25 V電流2.5 mA，CaM轉(zhuǎn)膜9 min，CaMKⅡ 轉(zhuǎn)膜13 min，8%奶粉37 ℃封閉孵育1 h，加入一抗37 ℃ 封閉1 h，4 ℃過夜。TBST洗膜加二抗37 ℃孵育1 h。

洗膜后取ECL試劑A液、B液等體積混合加在膜上3～5 min，暗室膠片曝光、顯影、定影，掃描膠片并保存圖片，Image J軟件分析條帶光密度值，將目的條帶與β-actin的光密度比值作為目的蛋白的相對量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)輸入 SPSS 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,以P<0.05 表示組間差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 CaMmRNA及CaMKⅡmRNA在大鼠海馬發(fā)育中的變化 由表2可見，出生后第1天的 CaM mRNA相對表達量較低，出生后第7～50天的CaM mRNA相對表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。CaMKⅡmRNA在出生后第1～7天相對表達量較低，出生后第14～50 天相對表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 CaMmRNA、 CaMKⅡmRNA在大鼠海馬發(fā)育中的變化 (n=6;±s)

注：與第1天組比較，①P<0.05, ②P<0.01

2.2 CaM蛋白及CaMKⅡ蛋白在海馬發(fā)育中的表達 使用Western blot方法揭示各組CaM蛋白和CaMKⅡ蛋白的表達。由表3可見，CaM蛋白在出生后第1天相對表達量較低，出生后第7～50天的相對表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。CaMKⅡ蛋白在出生后第1～7天相對表達量較低，出生后第14～50天相對表達量明顯增高 (P<0.01)。

表3 CaM蛋白、 CaMKⅡ蛋白在大鼠海馬發(fā)育中的變化 (n=6;±s)

注：與第1天組比較，①P<0.05, ②P<0.01

3 討 論

活動依賴的突觸可塑性發(fā)育存在一個關(guān)鍵期,其調(diào)控分子和細胞機制的核心是細胞內(nèi)鈣水平的變化。也就是說,啟動活動依賴的突觸可塑性的各種信號,包括神經(jīng)遞質(zhì)及其他神經(jīng)營養(yǎng)因子等,最終都會影響細胞內(nèi)的Ca2+水平。細胞內(nèi)Ca2+增加可以激活一系列激酶,從而導(dǎo)致細胞骨架的修飾以及神經(jīng)元樹突的形態(tài)改變，并且通過基因表達來體現(xiàn)功能改變[6]。

鈣調(diào)蛋白是一種在所有真核生物體內(nèi)均有表達的識別Ca2+的信號蛋白，在腦內(nèi)主要分布在海馬、紋狀體和大腦皮質(zhì),大約占腦蛋白的0.5%。CaM存在于神經(jīng)元的許多亞細胞成分中,在胞漿液、線粒體、微粒體和突觸泡漿等部分都有分布。鈣調(diào)蛋白濃度與腦的正常功能有著重要的聯(lián)系[7]。它能與Ca2+結(jié)合，將胞內(nèi)Ca2+濃度變化的信號傳遞給多種依賴Ca2+而發(fā)揮生物學(xué)功能的蛋白。CaMKⅡ占PSD組分蛋白總量的20%～30%，是一種鈣依賴性蛋白激酶，在海馬突觸中分布密集。CaMKⅡ是神經(jīng)系統(tǒng)特異表達的蛋白，并且具有發(fā)育階段特異性,即只在生后表達。Silva等[8]研究證明當(dāng)用基因打靶技術(shù)敲除小鼠的CaMKⅡ亞基后海馬和新皮層的細胞形態(tài)和NMDA受體通道功能都正常，但在海馬腦片上不能夠誘導(dǎo)出LTP。由此也說明CaMKⅡ在突觸可塑性中起著重要作用。

本實驗對大鼠海馬CaM、CaMKⅡ的發(fā)育研究發(fā)現(xiàn), 在出生后第1天,無論是基因水平還是蛋白水平表達均較弱；出生后第14～30天,其表達明顯增強；在出生后第50天，其基因和蛋白水平表達均持續(xù)在高水平。由于LTP的產(chǎn)生，主要是由突觸后Ca2+濃度的升高，大量Ca2+可作為第二信使進一步激活胞內(nèi)的生化級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致突觸的可塑性變化。內(nèi)流的Ca2+與CaM形成Ca2+/CaM復(fù)合物,從而使CaMKⅡ激活,導(dǎo)致AMPA受體磷酸化增加；Ca2+/CaM還可以激活腺苷酸環(huán)化酶使PKA活化,最終使突觸后膜上AMPA受體數(shù)量增加。活化的CaMKⅡ還能激活Ras鳥苷酸交換因子活化Ras-ERK通路,促進LTP的啟動。因此推測CaM、CaMKⅡ出生后的變化可能與突觸的發(fā)育和成熟有關(guān)。以往的研究表明，腦的發(fā)育與突觸的形成之間存在著某種平行關(guān)系。在腦發(fā)育關(guān)鍵期(胎兒期和生后早期)，神經(jīng)元形成大量新突觸連接，使腦中突觸的數(shù)量最終達到成熟腦的兩倍[9，10]。這一關(guān)鍵期對于人類而言是從妊娠后3個月至出生后2年，而嚙齒類動物則為胚胎后期至出生后3～4周。在腦快速發(fā)育期之后，突觸聯(lián)系的減少是機體對早期產(chǎn)生的過多的突觸進行修剪[11,12]，以適應(yīng)腦的成熟和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建過程。在本研究中，CaM、CaMKⅡ出生后第1天達較弱，可能與海馬突觸發(fā)育尚不成熟有關(guān)；CaM、CaMKⅡ出生后第14～30天 的表達明顯增強，顯然正反映了海馬的快速發(fā)育和突觸聯(lián)系增多過程。出生后第50天其基因和蛋白水平表達處于較高水平，但較出生后第21天已有所減弱趨勢，說明隨著腦發(fā)育成熟，機體對多余的突觸進行修剪。因此，CaM和CaMKⅡ在海馬中的特異性表達與突觸的發(fā)育及成熟變化密切相關(guān)。

總之，CaM和CaMKⅡ的表達與神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的發(fā)育和成熟密切相關(guān)，同時也與學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)，因而對CaM和CaMKⅡ在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)育規(guī)律的研究，可為認知功能障礙相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

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(2014-08-12收稿 2014-11-15修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

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Expression of Calmodulin and Ca2+/calmodulin kinaseⅡ in rat hippocampus during development stage

WANG Shaobo1, MOU Xinhong2, MENG Bin3, FU Zhengying4, and ZHANG Yinguo5.

1.Tianjin Uninversity of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2.Department of Basic Experimental Technology, 3.Department of Health, 4.Department of Gynaecology and Obstetrics of Affiliated Hospital, 5.Department of Physiology and Pathophysiology, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309,China

Objective To study the changes in expressions of CaM、CaMKⅡmRNA and protein in the hippocampus of rat during postnatal development. Methods Real-time PCR and Western blot were used to detect the different expressions of mRNA and protein levels of CaM,CaMKⅡ,respectively, in postnatal day 1, day 7, day 14, day 21, day 30 and day 50． Results The expression of CaM and CaMKⅡwere weaker in the first day after birth, but increased rapidly at postnatal days 14-30 (P<0.05 orP<0.01). The expressions continued to a higher level at postnatal day 50 (the relative values of CaMmRNA and CaMKⅡmRNA were 2.242±0.154 and 2.418±0.329, respectively; the relative values of CaM protein and CaMKⅡprotein were 0.782±0.061 and 2.194±0.256, respectively)(P<0.05 orP<0.01), but had low expression trend compared with postnatal day 21. Conclusions There is certain time sequence in the expressions of CaM/CaMKⅡmRNA and protein in the hippocampus of rat during postnatal development. This pattern may be closely related to the change of synaptic development and brain maturity. It is also closely related to the formation of learning and memory.

calmodulin；Ca2+/calmodulin kinaseⅡ; hippocampus；cognition

國家自然科學(xué)基金(81271224); 武警后勤學(xué)院創(chuàng)新團隊基金 (WHTD 201308)

王少博，碩士研究生在讀， E-mail:shaobo03786@163.com

1. 天津 300193, 天津中醫(yī)藥大學(xué); 2.基礎(chǔ)實驗技術(shù)教研室， 3.衛(wèi)生教研室， 4.附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 5.生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，天津300309, 武警后勤學(xué)院

張引國， E-mail: yinguozh@sohu.com

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