師文靜，廖 莎，孫啟梅，王鵬翔，李曉姝

（中國石油化工股份有限公司 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

綜合評述

微藻采集分離技術(shù)概述

師文靜，廖 莎，孫啟梅，王鵬翔，李曉姝

（中國石油化工股份有限公司 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

微藻是廣泛存在于自然水體中，種類繁多，不同種類的藻種特征形狀不同，只有從自然水體中獲得純的目標(biāo)藻種才能進(jìn)一步開展藻種的選育和培養(yǎng)等研究工作。介紹了微藻的采集和分離方法，主要介紹了從自然水體獲得單一純藻種的步驟，重點(diǎn)描述了藻種的一些常用的分離方法和步驟，以期能夠獲得純的目標(biāo)藻種，為進(jìn)一步的微藻研究工作打好基礎(chǔ)。

微藻； 采集； 分離

化石燃料的消耗和全球環(huán)境污染的加劇，使可再生、無污染的新能源開發(fā)與利用成為研究的熱點(diǎn)[1,2]。生物柴油具有清潔性、可再生性的優(yōu)點(diǎn)，近年來受到研究者們的廣泛關(guān)注[3]。生物柴油是以動物油脂（牛油、豬油）、植物油脂（大豆油、玉米油，油棕）或者微生物油脂（微藻）等可再生的生物材料為原料的含氧清潔燃料，其主要組成成分是與石油柴油性能非常相近的脂肪酸甲酯。與石化柴油相比，生物柴油具有良好的燃燒性，高效的能量轉(zhuǎn)化率，優(yōu)良的潤滑性和較高的安全性等眾多優(yōu)勢[4]。它是一種無毒燃料[5]，可以被生物降解，是優(yōu)質(zhì)石化柴油的理想替代燃料。

美國能源專家如此評價(jià)：生物柴油擁有比食鹽還小的毒性，比糖類還快的降解速度。微藻具有資源豐富、生長迅速、油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)，將成為生產(chǎn)生物柴油的重要的油脂來源[6,7]。微藻是以快速生長和高能源含量著稱的單細(xì)胞光合有機(jī)體，微藻能有效利用太陽能，將H2O、CO2和無機(jī)鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，是地球上最古老的初級生產(chǎn)者之一[8]，是最大的自養(yǎng)類微生物植物[9]。微藻不僅在水生生態(tài)系統(tǒng)如湖泊，河流和海洋中生長，而且也在極端環(huán)境如火山水和鹽水域中生長[10]。我國的海岸線長，有廣闊的沿海和內(nèi)地湖泊水域地區(qū)，為我國發(fā)展微藻柴油有著巨大地域優(yōu)勢[11]。微藻富含糖、氨基酸和高不飽和脂肪酸等，可以用于生產(chǎn)膳食補(bǔ)充劑、動物飼料、生物燃料和一些高附加值的生物活性成分[12]。

微藻在自然界分布廣泛并且種類繁多，其中許多種類不僅能利用二氧化碳進(jìn)行光能自養(yǎng)生長，同時(shí)也能利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長來獲取微藻生物質(zhì)[13]。但是自然水體中的多種微藻混合存在，采集的水樣中同時(shí)還有浮游動物（攝食者）和菌類，必須先將單個藻細(xì)胞分離出來，獲得單細(xì)胞克隆，才能夠保存和培養(yǎng)，進(jìn)行深入研究。因此如何從原始水樣獲得單克隆藻種是微藻培養(yǎng)和應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14,15]。

一般來說，獲得單克隆藻種需要經(jīng)過水樣采集、預(yù)處理及分離等流程。本文從原始水樣的采集、樣品的預(yù)培養(yǎng)、純藻種的分離三個步驟對微藻不同的分離方法進(jìn)行了概述。

1 樣品采集

微藻的種類繁多，廣泛的存在于自然水體中，眾多種類的微藻在自然界中存在的形式也不同，有的屬于浮游種類，有的屬于底棲附著種類[16]。不同類別的生長的生態(tài)環(huán)境不一樣，因此采集的地點(diǎn)和方法、季節(jié)會有所不同。比如，金藻、硅藻常在低溫的季節(jié)出現(xiàn)，并且硅藻常附著在水體的巖石上，采集時(shí)需要用工具刮去藻體后放在采樣瓶中。又比如，藍(lán)藻通常喜歡在高溫的條件下生長，因此適合于夏季采集。有些藻類的分布還與水體的環(huán)境質(zhì)量相關(guān)，眼蟲藻、衣藻、卡德藻等常在含有較多有機(jī)污染物的靜止水中出現(xiàn)。團(tuán)藻、綠藻、藍(lán)藻、裸藻主要存在于在中度污染的水體中, 硅藻類、金藻類和甲藻類主要在清潔的水體中可以找到[17]。此外，還可以利用藻類的趨光性進(jìn)行初步分離采集的藻種樣品，例如可以利用顫藻的趨光能動性將其與采集附著的泥沙分離[18]。總之，要得到盡可能多的微藻藻種，需要我們在采集過程中不斷摸索，不斷的進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)積累。

不同藻類所需的采集工具和方法也不同，浮游藻類可以采用25#浮游生物網(wǎng)進(jìn)行采集，將采集的藻放在裝有培養(yǎng)基的樣品瓶中，也可用采水器進(jìn)行采集獲得。常附著在水中巖石或者其他附著物（枝葉、水草）上的底棲藻類采集時(shí)可用鏟子將藻標(biāo)本刮取下來放在樣品瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。對于一些容易在短期內(nèi)死亡的鞭毛藻類采集時(shí)應(yīng)放在裝有培養(yǎng)液的樣品瓶中，并在短期內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)分離[19]。

2 樣品的預(yù)培養(yǎng)

由于采集的樣品中目標(biāo)藻種的密度可能比較低，分離難度比較大，分離培養(yǎng)也容易造成死亡，因此最好先對采集樣品進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)備培養(yǎng)主要包括樣品的預(yù)處理和樣品的富集培養(yǎng)兩個步驟。

2.1 樣品的預(yù)處理

從野外采來的水樣有時(shí)雜質(zhì)比較多，有的含有沉積物、絲狀巨藻或者纖毛蟲等原生動物，如果直接用來富集培養(yǎng)和藻種分離，往往會導(dǎo)致藻種富集預(yù)培養(yǎng)的失敗，因此必須對采集的水樣進(jìn)行初步的預(yù)處理，一般采集的水樣用300目的網(wǎng)絹進(jìn)行過濾，過濾后的樣品再進(jìn)行富集預(yù)培養(yǎng)。

2.2 樣品的富集培養(yǎng)

一般來說用處理過的初始樣品直接進(jìn)行分離，由于樣品中藻細(xì)胞密度比較低，因此容易造成分離培養(yǎng)的失敗，為了避免直接對采集樣品分離培養(yǎng)的失敗，可先對過濾處理的樣品進(jìn)行富集預(yù)培養(yǎng)，使樣品中的藻細(xì)胞達(dá)到一定密度后有利于目標(biāo)藻種的分離培養(yǎng)。

根據(jù)所要分離獲得的目標(biāo)藻種的種類來選擇適合不同目標(biāo)藻種的生長條件和培養(yǎng)來進(jìn)行培養(yǎng)，一般來說淡水中綠藻可以采用SE和BG11培養(yǎng)基，藍(lán)藻采用BG11培養(yǎng)基，硅藻可以采用D1培養(yǎng)基，對于海水藻可以采用 f/2培養(yǎng)基。同時(shí)為了獲得盡可能多的目標(biāo)藻種，我們可以把樣品分成若干份，然后分別接種于不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由于樣品中藻細(xì)胞濃度比較低，因此培養(yǎng)基中接種原始樣品的比例比較高，一般為1/ 4～1/ 2。對于一些難以獲得的目標(biāo)藻種，可以在培養(yǎng)基中加入適量的土壤提取液和微量元素以加速目標(biāo)藻種的生長，同時(shí)接種的樣品中如果含有較多的雜菌影響目標(biāo)藻類的生長，可以采用添加微量的抗生素和選擇性抑制劑的方式來抑制雜菌的生長，從而使目標(biāo)藻種能夠生長起來。培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)液的顏色稍有變化時(shí)，可以用顯微鏡觀察培養(yǎng)液中目標(biāo)藻類是否占有優(yōu)勢，目標(biāo)藻類達(dá)到優(yōu)勢時(shí)便可以進(jìn)行下一步的分離工作[14]。

3 分 離

3.1 微吸管分離法

將玻璃毛細(xì)管在酒精燈上加熱，用鑷子拉成極細(xì)的微管。 將微吸管放入水樣(標(biāo)本)的瞬間，毛細(xì)管會自動吸入微量的水樣，微藻隨水樣被吸入毛細(xì)管，將吸入水樣(標(biāo)本)吹放在載玻片上，在10倍或20倍顯微鏡下觀察，在水滴中找到需要分離的目標(biāo)藻種，用微吸管再次吸取目標(biāo)藻種，滴在載玻片上,重復(fù)數(shù)次, 直到獲得單個的目標(biāo)藻種，移入裝有經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基（約1 mL）的試管中靜置培養(yǎng)[15]。

由于吸取的藻細(xì)胞為單個藻細(xì)胞，因此該法的優(yōu)點(diǎn)是僅用分離一次就可以獲得單克隆藻種，但是該種分離方法操作起來比較復(fù)雜，對于微小的藻細(xì)胞不好吸取，所以只適合于細(xì)胞較大的藻類[14]。同時(shí)由于為單個藻細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度很低，很容易造成分離培養(yǎng)的失敗。

3.2 噴霧技術(shù)

Wiedemanl在上世紀(jì)60年代建立了一種簡單的分離純化方法，將待分離的藻液樣品放入滅菌的離心管中進(jìn)行離心，在轉(zhuǎn)速2 000 r/min下離心45～90 s，倒去上清液，然后加入滅菌后的蒸餾水或者按上述步驟離心洗滌10～12次。將夾斷的毛細(xì)管插入離心管底部，離心管口用棉花塞住，毛細(xì)管要略長于離心管，保證毛細(xì)管一部分在棉花之上。用壓縮空氣經(jīng)無菌過濾后吹在毛細(xì)管內(nèi)，把從固定的離心管里的藻細(xì)胞均勻吹出，吹出的藻細(xì)胞均勻噴撒在在提前準(zhǔn)備好的裝有滅菌的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。操作完成后，將培養(yǎng)皿放在何時(shí)的光照和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，一段時(shí)間后，培養(yǎng)皿上有單藻落長出后將單藻落用毛細(xì)管跳出來接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3.3 稀釋分離法

把待分離的經(jīng)過富集培養(yǎng)的藻液樣品用滅菌過培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋稀釋，稀釋倍數(shù)根據(jù)鏡檢情況而定，直到鏡檢時(shí)每滴藻液里只有一個藻細(xì)胞為止，將稀釋后的藻液吸取一滴接入預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有無菌的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞達(dá)到一定密度后進(jìn)行鏡檢看藻液是否為單種，若為單種則分離純化成功，若不純需要繼續(xù)純化直到分離出藻液為單種為止[14,15]。

此種分離方法操作比較簡便，對微藻細(xì)胞的大小沒有限制，一次可進(jìn)行多個操作，成功率較高[14,15]。

3.4 固體培養(yǎng)基分離法

3.4.1 平板劃線法

當(dāng)藻細(xì)胞的直接小于10 μm時(shí)，可以采用劃平板法或平板涂布分離法進(jìn)行藻種分離[16]。在培養(yǎng)基中加入含量為1%～2%的瓊脂進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌結(jié)束后待培養(yǎng)液的溫度涼至大約 40～50 ℃時(shí)將培養(yǎng)基迅速倒入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻后即制成固體培養(yǎng)基備用。將接種環(huán)經(jīng)過酒精燈火焰滅菌后在無菌操作的條件下蘸取少量藻液以劃線的方式接入備用的固體培養(yǎng)基中，平板劃線可采用平行劃線、扇形劃線及其他連續(xù)劃線的方式。劃線后的平板在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一周左右挑取單藻落接入到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間后在顯微鏡下觀察是否為單藻株，若不是單藻株繼續(xù)用上述方法進(jìn)行純化，直到獲得單克隆藻種為止。

3.4.2 平板涂布法

該方法與平板劃線法相類似，只是接種時(shí)是將稀釋的藻液用涂布棒均勻的涂在滅菌的培養(yǎng)基表面上。涂布后的平板放在合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間后，繼續(xù)上述平板劃線法中的鏡檢步驟，直到獲得單克隆藻種為止[20]。

4 結(jié)束語

在自然環(huán)境中存在大量具有開發(fā)利用價(jià)值的高效產(chǎn)油微藻，如何從自然界水體中獲得高品質(zhì)優(yōu)良品質(zhì)的微藻是微藻研究工作一個亟待解決的問題；同時(shí)在微藻的培養(yǎng)和應(yīng)用中，由于種種原因，所培養(yǎng)的純藻種易被其他的雜藻或微生物污染，如果不及時(shí)分離純化會導(dǎo)致后續(xù)培養(yǎng)的失敗，因此采取合適的分離方法對藻種進(jìn)行分離是至關(guān)重要的[15]?？蒲泄ぷ髡咧挥惺煜げ煌孱惖纳鷳B(tài)特征才能選擇正確的分離方法獲得優(yōu)良的目標(biāo)藻種。

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Overview on the Microalgae Collection and Separation Technology

SHI Wen-jing, LIAO Sha, SUN Qi-mei, WANG Peng-xiang, LI Xiao-shu
(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Liaoning Fushun 113001, China)

Microalgae widely exist in natural waters. Different microalgae have different shape and characteristics. Only obtaining pure goal algae from natural water bodies is basis to further carry out algae species breeding and cultivation research. In this paper, microalgae collection and separation methods were described, the steps to obtain a single pure algae strains from natural water bodies were introduced, and common separation methods and steps of microalgae were discussed, which could provide some reference for microalgae separation work.

Microalgae; Collection; Separation

Q 949.93

A

1671-0460（2015）08-1993-03

中國石油化工集團(tuán)投資項(xiàng)目，項(xiàng)目號：213076。

2015-07-06

師文靜（1980-），女，陜西渭南人，工程師，碩士，2007年畢業(yè)于西北大學(xué)工業(yè)催化專業(yè)，研究方向：微藻生物能源開發(fā)技術(shù)工作。E-mail：shiwenjing.fshy@sinopec.com，電話：02456389765。