劉 輝，宮殿良

（中糧生化能源（肇東）有限公司， 黑龍江 肇東 151100）

發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇過程中野生酵母的污染和控制

劉 輝，宮殿良

（中糧生化能源（肇東）有限公司， 黑龍江 肇東 151100）

綜述了燃料乙醇發(fā)酵過程中野生酵母的污染來源、檢測方法以及預(yù)防和控制。利用這些信息，可以在實際生產(chǎn)中有效控制野生酵母，以提高工廠燃料乙醇的收率。

野生酵母；燃料乙醇；發(fā)酵；控制

野生酵母是指在發(fā)酵過程中不能完全控制或是不需要的一類酵母[1]。野生酵母可能是來自很多方面，例如被污染的培養(yǎng)基、雜質(zhì)含量高的谷物、生產(chǎn)中的循環(huán)系統(tǒng)、活性干酵母或是酵母乳等初始來源的酵母、種子罐、未除菌的空氣和不衛(wèi)生的設(shè)備和場地等[2]。另外，同其他的污染微生物一樣，這些野生酵母很可能由昆蟲所傳播，這些昆蟲破壞了原料或是在工廠內(nèi)傳播[3]。這些野生酵母的污染可以引起酒精產(chǎn)量或是生產(chǎn)率的下降。有時候由于野生酵母的污染，乙醇產(chǎn)量甚至可以降低百分之一，這將會對原本利潤不高的燃料乙醇工廠造成不利影響。因此，對野生酵母有一個詳盡的了解、檢測及抵御措施變得尤為重要。本文從對野生酵母的介紹、檢測方法、預(yù)防與控制三個方面進(jìn)行綜述。

1 野生酵母

野生釀酒酵母的定義很難去描述。然而，假設(shè)我們按照以上提出的概念，那么不能用來發(fā)酵的酵母都可以稱之為野生酵母。嚴(yán)格來講，A車間的酵母可被定義為B車間的野生酵母。很大程度上，野生酵母相對于生產(chǎn)酵母具有可改變的生化和生理特性。很多釀酒酵母可以產(chǎn)硫化氫和較高水平的乙酸，這說明在釀酒酵母屬中存在很大程度的代謝多樣性。事實上，有的釀酒酵母會產(chǎn)生有毒因子來殺死其他酵母，例如眾所周知的zymocins毒素。實驗室的酵母及從自然分離出的酵母也大多對其他酵母有一定的毒害作用。在發(fā)酵生產(chǎn)中，乙醇產(chǎn)量降低、生產(chǎn)率下降或是酵母生長不好等都可能源自野生酵母污染。但有時，上述出現(xiàn)的這些情況也不會那么明顯[4]。如果是連續(xù)發(fā)酵或是酵母反復(fù)使用，這種微小的變化可能被放大。有時這種由野生酵母引起的微小變化很難被檢測到，成為潛在的危害。

除了釀酒型野生酵母以外，很多菌株包括酒香酵母，假絲酵母，隱球酵母，德巴利酵母屬，德克酵母，內(nèi)真菌屬酵母，網(wǎng)孢菌屬酵母，克魯維屬酵母，裂殖酵母屬，球擬酵母等，經(jīng)常在酒精發(fā)酵企業(yè)中被發(fā)現(xiàn)[5]。例如，很多文獻(xiàn)報道了德克酵母在白酒行業(yè)中被看做是最具有破壞性的野生酵母。而且，德克酵母在啤酒行業(yè)甚至是軟飲料行業(yè)也被看做是典型的野生污染酵母。這些酵母可以生產(chǎn)大量的乙酸來抑制常規(guī)酵母。目前，在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，德克酵母已經(jīng)得到各廠家的重視，尤其是在連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工藝中備受關(guān)注。隨著野生酵母數(shù)的增長，導(dǎo)致乙酸的大量生成、乙醇產(chǎn)量降低、發(fā)酵緩慢甚至發(fā)酵提前終止。經(jīng)檢測分析，在發(fā)酵成熟醪中并未檢出乙酸菌，而是含有許多異常的酵母細(xì)胞，可見，野生酵母是引起上述發(fā)酵異常的重要因素之一[6]。

在生產(chǎn)中，這些野生酵母代謝了本可以被生產(chǎn)酵母利用的糖，并生成了不利于生產(chǎn)酵母的物質(zhì)，從而使得酒精產(chǎn)量降低，生產(chǎn)率下降。覆蓋粘貼在這里正文內(nèi)容覆蓋粘貼在這里。

2 野生酵母的檢測

由于野生酵母特別是野生釀酒酵母的形態(tài)、生理和生化方面與常規(guī)酵母非常相似，所以很難進(jìn)行檢測。然而，隨著科技的進(jìn)步一系列的檢測技術(shù)被開發(fā)和使用來檢測野生酵母。經(jīng)典的鑒定方法包括電鏡、顯微鏡，形態(tài)學(xué)等等通常是適用的。但這些方法的主要問題是酵母需要在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這就造成檢測時間過長，不能及時的檢測出污染位置并且找到補救措施。因此，快速的分子方法就變得越來越流行。首先，最重要的任務(wù)是找到常規(guī)酵母全面的表征特性，用于區(qū)分其他的野生酵母。為了獲得大量的信息，就必須要做基因鑒定，通常是鑒定到種。精密的分析一般都是基于基因分析，這就使分析更加復(fù)雜并且需要使用特殊的工具和特殊訓(xùn)練。

目前來看，沒有一個簡單的方法或材料可以同時檢測到常規(guī)酵母和所有的野生酵母。相差顯微鏡很可能是從常規(guī)酵母中分辨出野生酵母最簡單的技術(shù)。釀酒酵母是典型的圓形或橢圓形，而許多野生酵母是細(xì)長的或是奇怪的形狀，往往還有成串的趨勢。傳統(tǒng)的方法，可以用醋酸鉀或醋酸銨來試驗產(chǎn)孢子能力從而檢測野生酵母[7]。在顯微鏡實驗中，可以區(qū)分產(chǎn)芽孢的野生酵母和正常生產(chǎn)酵母，因為正常酵母已經(jīng)失去了它們的產(chǎn)孢能力。其他類型的顯微鏡如免疫熒光染色顯微鏡，也常常用于檢測野生酵母，但是這些技術(shù)靈敏性和專一性不是很好[8]。大部分檢測野生酵母的方法是使用不同的選擇培養(yǎng)基，因為污染的酵母通常數(shù)量較少，需要進(jìn)行擴培才能準(zhǔn)確的估計出其數(shù)量。在過去的幾十年里，研究人員開發(fā)出大量的固體培養(yǎng)基用來檢測野生酵母菌。這些培養(yǎng)基有選擇性的被設(shè)計成有助于或是抑制一種特定的酵母。從根本上講，所有的選擇培養(yǎng)基都會添加一種抑制組分如硫酸銅，結(jié)晶紫等，或是添加一種常規(guī)酵母無法使用的物質(zhì)如賴氨酸、硝酸鹽、木糖和糊精等。例如放線菌酮，是一種酵母選擇性抑制劑，可以阻礙蛋白合成的啟動和延長，從而抑制釀酒酵母的生長。但是很多非釀酒酵母例如德克酵母、克勒克酵母和粟酒酵母對放線菌酮有耐受性。因此，放線菌酮提供了一個非常好的篩選工具來檢測非釀酒酵母[9]。

品紅亞硫酸可以用來抑制正常酵母，而不抑制野生酵母。但是，在這種情況下，需要對抑制劑的加量進(jìn)行優(yōu)化，因為如果加量較低，常規(guī)酵母也可以進(jìn)行生長。這些化學(xué)品的批次不同抑制情況也有差別。所以，常規(guī)酵母需要經(jīng)常在每一種培養(yǎng)基中試驗，通過判斷哪種組分在培養(yǎng)基需要添加。類似的培養(yǎng)基還有結(jié)晶紫SDM培養(yǎng)基等等。

其他的選擇培養(yǎng)基不依賴于上述生長抑制劑，而是使用一種特定的底物僅可以供特定酵母生長。賴氨酸培養(yǎng)基、CLEN培養(yǎng)基和XMACS培養(yǎng)基都是利用這種原則培養(yǎng)基的例子。常規(guī)酵母無法利用賴氨酸作為唯一的氮源，這種培養(yǎng)基可以用來篩選非釀酒野生酵母[10]。

除了上述培養(yǎng)基和其他選擇培養(yǎng)基外，還有許多不同的培養(yǎng)基用來檢測野生酵母。例如，包含pH敏感的溴甲酚綠用來檢測產(chǎn)酸酵母，因為很多酵母都可以產(chǎn)酸?；A(chǔ)培養(yǎng)基添加0.5%w/v的CaCO3對于分離產(chǎn)酸酵母很有效果，因為產(chǎn)酸酵母在這種培養(yǎng)基中會在菌落周圍產(chǎn)生明顯的圈[11]。

20世紀(jì)80年代，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)鑒定技術(shù)逐漸發(fā)展起來，鑒定酵母菌的方法主要有：G+C%測定、輔酶Q系的測試、酵母胞壁甘露聚糖核磁共振氫譜(PRA)測試、確定單倍體細(xì)胞中DNA含量、以及DNA-RNA和DNA-DNA雜交重組的研究。這些新技術(shù)不僅為野生酵母鑒定提供了快速簡便的方法，而且更加精準(zhǔn)[12]。

3 野生酵母的預(yù)防與控制

野生酵母污染的一個重要來源是在常規(guī)酵母生產(chǎn)過程中的干燥，壓縮或是混合的時候出現(xiàn)的。由于在生產(chǎn)過程中大多數(shù)酵母是連續(xù)培養(yǎng)，所以在工廠發(fā)酵初始培養(yǎng)時低水平的雜菌（細(xì)菌和真菌）污染無處不在。然而污染程度在工段之間，甚至是批次之間都是有變化的。因此有必要定期監(jiān)測這些培養(yǎng)液中的雜菌，甚至是稀釋的酵母接種醪液里也需要監(jiān)測。如果不經(jīng)過正確處理，儲存或是殺菌，未過濾的空氣，水，甚至是酶制劑也都可能是野生酵母的來源。玉米和其他原料間也是野生酵母的一個重要來源。那些不光滑的表面，包括閥門、墊片管道死角以及CIP系統(tǒng)的隱蔽處都有可能出問題，因為它們很難被徹底消毒。工廠內(nèi)部衛(wèi)生條件不好，野生酵母可能通過昆蟲進(jìn)行傳播，從而在糖中，水中或是玉米顆粒中生存[13]。盡管使用熱堿液對管道、罐以及輸送泵進(jìn)行消毒，或是在發(fā)酵過程中使用抗生素或其他殺菌劑，但是也需要額外細(xì)致的工作來保證環(huán)境衛(wèi)生。換熱器中用來換熱的水也是野生酵母的重要來源。最后，在沒有適當(dāng)?shù)拇胧┫拢湍富厥绽没蚴瞧渌^程（清液回配）也容易引起野生酵母污染。相對于酵母的回收利用，用酸洗可以有效的限制細(xì)菌但是對于很多野生酵母限制效果有限。最保險的辦法就是使用活化罐對質(zhì)量好的酵母進(jìn)行重新培養(yǎng)。盡管可能會有一些由微生物代謝的抑制化合物隨著清液回到前段工序但對于清液回配或是其他回配的水來說，它們應(yīng)該重新再回到前段拌料工序來避免污染。從根本上說，好的衛(wèi)生條件，適當(dāng)?shù)膬Υ婧吞幚砜梢宰柚挂吧湍傅奈廴綶14]。此外，對生產(chǎn)過程的物料進(jìn)行日常微生物檢測，來確定“問題點”也可以預(yù)防污染的爆發(fā)。

有時候，盡管所有預(yù)防措施都使用了，野生酵母的污染還是會發(fā)生的。延長發(fā)酵時間或是循環(huán)使用酵母等都是比較敏感的問題。野生酵母的選擇性消除是比較困難的，因為大多數(shù)能殺死野生酵母的方法也能殺死正常生產(chǎn)酵母。例如，二氧化硫、二甲基二碳酸鹽和山梨酸用在白酒工業(yè)中，用來防止酵母的生長，這些對野生酵母和常規(guī)酵母都有抑制。同樣，用于控制野生酵母的過濾法、熱滅活法、殺菌劑、毒素法對所有酵母都是有害的[15]。所以，唯一的方法就是將發(fā)酵罐或是整個生產(chǎn)工段停下來進(jìn)行徹底的清洗和消毒。即使這樣，經(jīng)過幾個周期下來野生酵母又開始重新生長。所以，有必要再所有設(shè)備中執(zhí)行嚴(yán)格的清潔和消毒標(biāo)準(zhǔn)，保證野生酵母在全段工序被阻止。

4 結(jié)論與展望

盡管對于野生酵母的防范和控制措施的報道較少，但是通過對野生酵母的認(rèn)識，以及掌握了野生酵母的來源，并采用一系列的預(yù)防及控制方法，可以將污染程度控制到最低，從而來降低燃料乙醇生產(chǎn)中由野生酵母污染引起的經(jīng)濟損失。目前有很多的研究者正在研究這一方面的問題，相信未來會有更多的研究成果提供參考，發(fā)揮重大作用。

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Contamination and Control of Wild Yeast in the Production Process of Fuel Ethanol by Fermentation

LIU Hui，GONG Dian-liang
（COFCO Bio-energy(Zhaodong)Co., Ltd., Heilongjiang Zhaodong 151100，China）

The sources, detection methods, prevention and control of wild yeast in the production process of fuel ethanol by fermentation were reviewed. Using this information, we can effectively control the growth of the wild yeast in the actual production to improve the yield of ethanol.

wild yeast; fuel ethanol; fermentation; control

TQ 214

A

1671-0460（2015）08-2051-03

2015-07-08

劉輝（1972-），女，黑龍江肇東人，高級工程師，碩士，研究方向：主要從事谷物發(fā)酵生產(chǎn)酒精方面的研究工作。E-mail：liuhui06081997@163.com。