洪立立， 郭 志， 邢文閣， 王紹山， 楊雪玲， 王海龍

胰腺癌為常見消化道惡性腫瘤，首選治療方式是外科手術(shù)切除，但約80%患者就診時(shí)已失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)［1］。對(duì)于不可手術(shù)切除的胰腺癌，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）每年發(fā)布的各種惡性腫瘤臨床實(shí)踐指南倡導(dǎo)應(yīng)用多學(xué)科技術(shù)控制腫瘤生長(zhǎng)，改善患者生活質(zhì)量。近年采用高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）治療胰腺癌已獲得良好效果［2-3］，但如何改進(jìn)HIFU治療方式，對(duì)進(jìn)一步提高療效仍有重要意義。本研究觀察不同功率HIFU治療人胰腺癌移植瘤的有效性和安全性，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人胰腺癌細(xì)胞系

BALB/c-nu裸小鼠30只（SPF級(jí)，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，許可證號(hào)SCXK京2006-0008），雌雄各半，5～6 周齡，體重 18～20 g。人胰腺癌YY-1細(xì)胞系源于人胰腺癌導(dǎo)管上皮癌（天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)）。FEP-BY02型HIFU治療系統(tǒng)由北京源德醫(yī)療設(shè)備有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌YY-1細(xì)胞系接種于含10%胎牛血清的McCoy5A培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2絕對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察，確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)；以0.125%胰蛋白酶消化傳代，48～72 h 換液。

1.2.2 BALB/c-nu裸小鼠胰腺癌移植瘤模型建立及實(shí)驗(yàn)方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的瘤細(xì)胞用胰蛋白酶液消化、收集，加入PBS緩沖液制成2×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液；于每只裸小鼠右側(cè)背部皮下注射0.2 ml細(xì)胞懸液，接種后3～4周出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，模型建立成功。待移植瘤生長(zhǎng)至直徑約1 cm，隨機(jī)將裸小鼠分為低功率HIFU治療組（低功率組）、高功率HIFU治療組（高功率組）、空白對(duì)照組，每組10只。

1.2.3 治療方法 裸小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于自制鼠板，腫瘤表面皮膚涂耦合劑，水囊充滿脫氣水后輕壓于皮膚表面。定位確定HIFU治療區(qū)域后，于HIFU治療系統(tǒng)選擇腫瘤中心點(diǎn)并設(shè)置靶皮距，以連續(xù)掃描方式啟動(dòng)手動(dòng)治療程序。設(shè)置輸出功率：低功率組為200 W，高功率組為300 W；其它治療參數(shù)設(shè)置：?jiǎn)卧l(fā)射時(shí)間（t1）為990 ms，占空時(shí)間（t2）為 10 ms（t2/t1=1/99），總發(fā)射次數(shù)為4次。對(duì)照組同樣行麻醉、上機(jī)程序，但治療時(shí)關(guān)閉電功率。

1.2.4 療效判定 每2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑（L）和垂直方向最大橫徑（W）；計(jì)算腫瘤體積（V）：V（mm3）=LW2/2；不同時(shí)間所測(cè) V 與治療前腫瘤體積（V0）之比為腫瘤生長(zhǎng)速率（f）。

1.2.5 不良反應(yīng)觀察 術(shù)后1周內(nèi)觀察治療區(qū)皮膚受損情況，聲通道上組織有無損傷，內(nèi)臟有無損傷，腹腔內(nèi)有無出血、腹水等。

1.2.6 原位雜交技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率 HIFU輻照治療后7 d、14 d，低功率組、高功率組、對(duì)照組分別處死5只裸小鼠，獲取標(biāo)本制備腫瘤組織石蠟切片，每片加25～50μl辣根過氧化酶抗體，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后用蘇木精對(duì)比復(fù)染、脫水、透明、固封；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-生物素dUTP切口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)切片，陽性表達(dá)顯示腫瘤細(xì)胞核為棕色；400倍顯微鏡下每張切片取5個(gè)不同視野，分別計(jì)數(shù)高倍視野下陽性表達(dá)細(xì)胞所占癌細(xì)胞比例，取平均值作為最終值并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得全部資料建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間差異的比較用ANOVA方差分析，組內(nèi)兩兩比較用最小顯著差數(shù)法（LSD），P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積變化

HIFU治療前、治療后7 d，低功率組、高功率組、對(duì)照組裸小鼠腫瘤體積變化見表1。HIFU治療前各組腫瘤體積變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；治療后7 d低功率組和高功率組腫瘤體積與對(duì)照組比較均縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后7 d低功率組與高功率組腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 HIFU治療前后各組裸小鼠腫瘤體積變化 cm3

2.2 腫瘤生長(zhǎng)速率

低功率組、高功率組、對(duì)照組裸小鼠經(jīng)HIFU治療后人胰腺癌YY-1細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)曲線見圖1。HIFU 治療后 3、7、14 d，低功率組、高功率組腫瘤生長(zhǎng)速率均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低功率組腫瘤生長(zhǎng)速率與高功率組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 HIFU治療后各組腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 局部不良反應(yīng)

HIFU治療后，高功率組10只裸小鼠中6只（60%）即刻出現(xiàn)術(shù)區(qū)皮膚水腫，提示伴隨皮膚灼傷，約2 d后結(jié)痂，其中1只伴隨皮膚潰爛；低功率組中2只裸小鼠（20%）出現(xiàn)皮膚灼傷，均于3 d內(nèi)自愈。高功率組3只（30%）裸小鼠出現(xiàn)聲通道組織損傷，低功率組中未見聲通道組織損傷。各組裸小鼠均未見內(nèi)臟損傷、出血、腹水等不良反應(yīng)（表2）。

表2 HIFU治療后各組裸小鼠不良反應(yīng)觀察 例（%）

2.4 腫瘤細(xì)胞凋亡率

HIFU治療后7 d，低功率組、高功率組、對(duì)照組裸小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率分別為（63.6±15.2）%、（75.2±11.1）%、（19.0±2.43）%，低功率組、高功率組腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），兩組間腫瘤細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.185）；治療后14 d，低功率組、高功率組、對(duì)照組裸小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡率分別為（41.4±7.3）%、（55.2±8.9）%、（18.0±2.4）%，低功率組、高功率組凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），兩組間腫瘤細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2）。

①治療后7 d，對(duì)照組無腫瘤細(xì)胞凋亡有表達(dá)；②治療后14 d，對(duì)照組無腫瘤細(xì)胞凋亡表達(dá)較前無明顯變化；③低功率組治療后7 d，腫瘤細(xì)胞凋亡表達(dá)；④低功率組治療后14 d，腫瘤細(xì)胞凋亡表達(dá)減低；⑤高功率組治療后7 d，腫瘤細(xì)胞凋亡表達(dá)；⑥高功率組治療后14 d，腫瘤細(xì)胞凋亡表達(dá)減低圖2 HIFU治療后各組裸小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡免疫組化染色（×200）

3 討論

HIFU治療作用機(jī)制包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)等［4］，其中熱效應(yīng)被認(rèn)為是HIFU最重要作用。有研究表明，消融效應(yīng)取決于溫度和暴露時(shí)間2個(gè)因素，殺滅腫瘤細(xì)胞所需溫度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)［5］。但通過提高HIFU治療功率獲取消融溫度的方法，不僅患者依從性差，安全性上也存在諸多隱患，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中均有皮膚灼傷、術(shù)區(qū)腹壁疼痛麻木、胃壁灼傷、腸穿孔及腸系膜上動(dòng)脈栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥的報(bào)道［6-7］。我們?cè)谇捌谂R床實(shí)踐中嘗試用降低HIFU功率的方法進(jìn)行治療并取得良好療效［8-9］，但尚缺乏相關(guān)基礎(chǔ)研究證據(jù)。

本研究采用提高單元發(fā)射時(shí)間（t1=990 ms）、縮短占空時(shí)間（t2=10 ms）的HIFU輻照模式，該治療參數(shù)2012年由Yuan等［10］報(bào)道用于治療胰腺癌，由于大大縮短了占空時(shí)間，使脈沖式發(fā)射方式更接近于連續(xù)發(fā)射模式，利于熱量在靶區(qū)沉積、減少熱量丟失，同時(shí)通過降低治療功率讓患者獲得更好的依從性。本研究結(jié)果表明，低功率組、高功率組HIFU治療后與對(duì)照組相比腫瘤體積縮小、生長(zhǎng)速度減慢（P＜0.05），說明不同功率HIFU輻照均能有效控制腫瘤生長(zhǎng)；低功率組與高功率組間腫瘤體積及生長(zhǎng)速率變化之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示降低HIFU治療功率也可獲得同樣療效；治療后8 d，低功率組和高功率組腫瘤均呈緩慢生長(zhǎng)趨勢(shì)，這可能與治療中未對(duì)腫瘤進(jìn)行完全消融有關(guān)。

本研究中觀察到HIFU治療的不良反應(yīng)主要為皮膚灼傷和聲通道組織損傷，未見內(nèi)臟損傷、出血及腹水等；與低功率組相比，高功率組不良反應(yīng)明顯增多（P＜0.05），說明低功率HIFU治療方法相對(duì)有更好的安全性。高功率組與低功率組均發(fā)生皮膚灼傷的原因與下列因素有關(guān)：①移植瘤體積相對(duì)較小，與皮膚距離較近（靶皮距＜1 cm）；②聲阻抗差異導(dǎo)致超聲波進(jìn)入組織時(shí)在水（或空氣）和皮膚界面處產(chǎn)生發(fā)射、折射等現(xiàn)象，可使局部熱能聚集，導(dǎo)致皮膚燒傷［11］；③HIFU治療系統(tǒng)在靶區(qū)轉(zhuǎn)化的熱量偏向分布于前場(chǎng)。相對(duì)于移植瘤實(shí)驗(yàn)研究環(huán)境，臨床上聲環(huán)境更為復(fù)雜，通過降低治療功率、縮短占空時(shí)間的HIFU輻照模式能否有效減少聲通道組織損傷，避免因空化效應(yīng)導(dǎo)致含氣的胃腸道發(fā)生損傷、穿孔等并發(fā)癥，有待于進(jìn)一步研究。

凋亡為細(xì)胞程序性死亡，其特征性變化為細(xì)胞膜快速起泡及核裂解。HIFU輻照除了使靶組織升溫而導(dǎo)致凝固性壞死，還可產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。有研究證實(shí)，HIFU輻照溫度接近熱凝固溫度時(shí)可最大程度地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。為觀察不同功率HIFU對(duì)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的作用，本研究用TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明不同功率HIFU均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，HIFU治療后7 d，低功率組與高功率組腫瘤細(xì)胞凋亡率均達(dá)到高峰，提示該時(shí)間可能是結(jié)合放、化療的最佳時(shí)機(jī)；治療后7 d、14 d低功率組與高功率組間腫瘤細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示低功率HIFU同樣可有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，利于臨床治療。

綜上，適當(dāng)降低HIFU功率有利于在確保人胰腺癌移植瘤治療效果的前提下減少不良反應(yīng)，具有一定的可行性，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，以尋找適合的治療功率。本研究尚存在一些不足之處，如皮下移植瘤模型尚不能精確模擬臨床聲環(huán)境，HIFU治療功率、治療劑量及輻照模式之間關(guān)系還需要更深入研究。

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