李 麗 劉文彥 苗文靜

（1濟寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照276826；2濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟寧272067；3日照市婦幼保健院，日照276826）

缺氧是呼吸的常見刺激因素，重度缺氧可損害呼吸中樞神經(jīng)元，引起呼吸抑制［1］。酸敏感離子通道（acid sensingion channel，ASICs）為非電壓門控的主要通道Na＋的通道，由細胞外酸化激活［2］。缺氧時無氧糖酵解增強，組織酸化，ASICs易被激活。已有研究表明，局灶性腦缺血缺氧后，腦室內(nèi)注射ASICs阻斷劑能明顯減輕腦組織的缺氧性損害［3］。由此推測，ASICs可能是引起缺氧性細胞損害的重要原因，而ASICs阻斷劑阿米洛利對此則具有保護作用。CO2可以間接通過H＋刺激中樞化學(xué)感受器引起呼吸興奮，而ASICs則在細胞外液［H＋］升高時被激活，故ASICs也可能在CO2引起的呼吸興奮效應(yīng)中發(fā)揮作用。本文通過腦室內(nèi)預(yù)先微注射阿米洛利，再給SD大鼠吸入低氧和高CO2氣體，以膈肌肌電為指標，觀察ASICs對大鼠缺氧性呼吸抑制及高CO2所致呼吸興奮反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

選用健康成年SD大鼠共40只，雌雄不拘，體重250～300g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。

1．2 主要試劑

阿米洛利購自Sigma公司。

1．3 實驗方法

健康成年SD大鼠隨機分為生理鹽水＋空氣對照組（n＝8）、生理鹽水＋低 O2組（n＝8）、生理鹽水＋高CO2組（n＝8）、阿米洛利＋低O2組（n＝8）、阿米洛利＋高CO2組（n＝8）。動物經(jīng)20%的烏拉坦以1000mg／kg的劑量腹腔注射麻醉后，分別行氣管插管、雙側(cè)迷走神經(jīng)分離并剪斷、劍突下暴露膈肌并記錄膈肌肌電等操作。將大鼠以先固定雙耳、再固定門齒的順序固定于腦立體定位儀中，且保持其頭位水平。參照Paxinos和Watson的《鼠腦立體定位圖譜》，以Bregma點向后1．0mm，中線旁開1．5mm處為穿刺點，通過微量進樣器垂直進針3．5～4．0mm向側(cè)腦室內(nèi)緩慢并勻速的注射藥物。

1．3．1 生理鹽水＋空氣對照組 先向其側(cè)腦室內(nèi)微注射生理鹽水（10μl），再向其氣管插管側(cè)管內(nèi)通入流量為200ml／min的空氣，在微量注射藥物前5min、注射藥物即刻每5min以膈肌肌電監(jiān)測1次呼吸，每次監(jiān)測1min。

1．3．2 生理鹽水＋低O2組 除向大鼠氣管插管側(cè)管內(nèi)通入相同流量的純氮氣外，其余操作同生理鹽水＋空氣對照組。

1．3．3 生理鹽水＋高CO2組 除向大鼠氣管插管側(cè)管通入相同流量的純CO2氣體外，其余操作同生理鹽水＋空氣對照組。

1．3．4 阿米洛利＋低O2組 除向大鼠側(cè)腦室內(nèi)微注射阿米洛利（10mM，10μl）外，其余操作同生理鹽水＋低O2組。

1．3．5 阿米洛利＋高CO2組 除向大鼠側(cè)腦室內(nèi)微注射阿米洛利（10mM，10μl）外，其余操作同生理鹽水＋高CO2組。手術(shù)操作結(jié)束后，待動物恢復(fù)30min后再進行側(cè)腦室微注射。膈肌肌電呼吸的變化以吸氣時程（inspiratory time，TI）、呼氣時程（expiratory time，TE）、呼吸頻率（respiratory frequency，RF）和吸氣幅度（amplitude of inspiration，Amp）為指標經(jīng)BL－420生物機能實驗系統(tǒng)進行觀察和分析。實驗結(jié)束后，向腦室內(nèi)注入20g／L美藍溶液0．5μl，處死動物開顱取腦，100ml／L甲醛固定24h，切開鑒定藥物注射部位，凡未注入側(cè)腦室的動物結(jié)果棄去。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17．0分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2．1 阿米洛利對大鼠缺氧所致呼吸抑制效應(yīng)的影響

生理鹽水＋空氣對照組大鼠，吸入空氣前后呼吸無明顯改變（P＞0．05）。腦室內(nèi)預(yù)注射生理鹽水對呼吸也未產(chǎn)生明顯影響（P＞0．05）。生理鹽水＋低O2組大鼠，缺氧即刻、缺氧后第10min、20min呼吸明顯興奮，即較缺氧前TI、TE明顯縮短；RF明顯增快；Amp明顯增大（P＜0．01）。缺氧后30 min呼吸明顯抑制，即較缺氧前TI明顯變短；TE明顯延長；RF明顯減慢；AMP明顯減小（P＜0．01）。阿米洛利＋低O2組大鼠，缺氧即刻、缺氧后第10min、20min呼吸效應(yīng)與生理鹽水＋低O2組動物無明顯差異，但缺氧后30min較缺氧前TI明顯縮短，TE明顯延長，RF明顯增快（P＜0．01），AMP較缺氧前無顯著變化（P＞0．01），即在缺氧后30min呼吸尚未出現(xiàn)明顯抑制。見表1、圖1。

2．2 阿米洛利對大鼠高CO2所致呼吸興奮效應(yīng)的影響

生理鹽水＋高CO2組大鼠，吸入CO21min內(nèi)，呼吸表現(xiàn)出明顯的興奮。即較吸入CO2前TI、TE明顯縮短；RF明顯增快；Amp明顯增大（P＜0．01）。阿米洛利＋高CO2組大鼠，吸入CO21min內(nèi)，呼吸也表現(xiàn)出明顯的興奮，以（｜CO21－pre－CO2｜／pre－CO2×100%）計算在吸入 CO2后1min的TI、TE、RF、Amp的變化率，阿米洛利＋高CO2組呼吸的變化率明顯低于生理鹽水＋高CO2組（P＜0．01）。見表2、表3、圖2。

表1 腦室內(nèi)注射阿米洛利對大鼠缺氧性呼吸抑制的影響

圖1 腦室內(nèi)注射阿米洛利對缺氧性呼吸抑制的影響

表2 腦室內(nèi)注射阿米洛利對氣管插管側(cè)管吸入純CO2氣體大鼠所致呼吸興奮的影響

表3 腦室內(nèi)注射阿米洛利對氣管插管側(cè)管吸入純CO2氣體大鼠所致呼吸反應(yīng)變化率的影響

圖2 腦室內(nèi)注射阿米洛利對氣管插管側(cè)管吸入純CO2大鼠所致呼吸興奮的影響

3 討論

3．1 阿米洛利對缺氧性呼吸抑制的保護作用

本文結(jié)果顯示，缺氧后大鼠先表現(xiàn)為呼吸興奮，缺氧后30min表現(xiàn)為明顯的抑制。缺氧后呼吸興奮的產(chǎn)生主要是刺激外周化學(xué)感受器所致，而缺氧后呼吸抑制效應(yīng)則是由呼吸中樞神經(jīng)元缺氧性損害所致。對于阿米洛利＋缺氧組動物，缺氧后30min較缺氧前尚未表現(xiàn)出明顯的抑制，提示阿米洛利對缺氧性呼吸抑制有保護作用。Miyake等［4］研究表明，在培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元，缺氧可使ASICs亞型ASICα表達明顯增多；將大鼠大腦中動脈閉塞后，大鼠皮層神經(jīng)元表達ASICα也明顯增多，提示ASICα與神經(jīng)元的缺氧性損害有關(guān)。缺氧性呼吸抑制時，腦干孤束核、斜方體核等呼吸相關(guān)核團ASICα表達明顯增多，提示ASICα是導(dǎo)致呼吸中樞神經(jīng)元缺氧性損害，進而導(dǎo)致呼吸抑制的重要原因［5］。缺氧可引起組織酸化，進而誘導(dǎo)ASICα的開放，引起大量Na＋內(nèi)流，導(dǎo)致細胞水腫，同時ASICα對Ca2＋也有較大通透性，加重細胞內(nèi)鈣超載，引起神經(jīng)元壞死。因此，ASICα被認為是非谷氨酸依賴性鈣毒性神經(jīng)元損傷的主要參與者［6］。阿米洛利是ASICs非特異性阻斷劑，因此能減弱ASICα引起的缺氧性損害，進而對缺氧性呼吸抑制發(fā)揮保護作用。

3．2 阿米洛利減弱高濃度CO2引起的呼吸興奮作用

本文結(jié)果顯示，吸入高濃度CO21min大鼠表現(xiàn)為呼吸興奮。吸入高濃度CO2引起呼吸興奮的效應(yīng)可通過刺激外周化學(xué)感受器和中樞化學(xué)感受器兩條途徑發(fā)揮作用。腦室內(nèi)注射阿米洛利后，減弱了由吸入高濃度CO2引起的呼吸興奮作用，即減弱了刺激中樞化學(xué)感受器的作用，故吸入高濃度CO2刺激中樞化學(xué)感受器引起的呼吸興奮效應(yīng)可能與ASICs有關(guān)。宋娜娜等［7］研究表明，在下丘腦外側(cè)區(qū)注射阿米洛利，再注射酸化的人工腦脊液能阻斷注射酸化人工腦脊液引起的呼吸興奮效應(yīng)。腦室內(nèi)預(yù)注射阿米洛利也能阻斷腦室內(nèi)注射酸化人工腦脊液引起的呼吸興奮效應(yīng)［8］。以上結(jié)果提示，ASICs是使中樞化學(xué)感受器受到刺激進而產(chǎn)生呼吸效應(yīng)的關(guān)鍵通道，由于吸入高濃度CO2引起呼吸興奮可通過刺激外周和中樞化學(xué)感受器兩條途徑發(fā)揮作用。因此，腦室內(nèi)注射阿米洛利可阻斷中樞化學(xué)感受器的作用，但刺激外周化學(xué)感受器的作用依然可以顯現(xiàn)出來。因此，腦室內(nèi)注射ASICs阻斷劑阿米洛利不能完全阻斷吸入高濃度CO2引起呼吸興奮效應(yīng)，只能減弱此效應(yīng)。

綜上所述，ASICs阻斷劑阿米洛利既對缺氧性呼吸抑制有保護作用，也可以減弱吸入高濃度CO2引起的呼吸興奮效應(yīng)，提示ASICs在缺氧和高CO2引起的呼吸效應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在上述兩種呼吸反應(yīng)中，究竟是ASICs哪種亞型發(fā)揮作用，還需更為深入地研究。

［1］ 李麗，王超，張靜．缺氧性呼吸抑制的中樞機制［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（17）：1341－1343．

［2］ 李麗．酸敏感的離子通道研究［J］．中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2010，5（1）：79－82．

［3］ 杜蕓蘭，朱立菁，陸生地，等．酸敏感離子通道1α介導(dǎo)缺氧皮質(zhì)神經(jīng)元損 傷及相關(guān)機制的探討［J］．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2007，24（5）：516－519．

［4］ Miyake T，Nishiwaki A，Yasukawa T，et al．Possible implications of acid－sensing ion channels in ischemia－induced retinal injury in rats［J］．Jpn J Ophthalmol，2013，57（1）：120－125．

［5］ 李麗，劉文彥，劉瑩．丹紅注射液延遲缺氧性呼吸抑制的發(fā)生及其機制［J］．中國病理生理雜志，2014，30（6）：1123－1126．

［6］ 向軍，唐宇平，蔡定芳．非谷氨酸依賴的鈣毒性機制在急性腦缺血損傷中的 作用［J］．中國病理生理雜志，2010，26（6）：1224－1228．

［7］ 宋娜娜．中樞酸敏感離子通道對呼吸的調(diào)節(jié)及機制研究［D］．上海：復(fù)旦大學(xué)，2010．

［8］ 李麗，劉文彥，高波．酸敏感離子通道在中樞化學(xué)感受器呼吸調(diào)節(jié)中的作用［J］．中國病理生理雜志，2014，30（8）：1400－1403．