徐文英 馬愷悅 馮孟鑫 顧選 李妍芃 趙百孝 劉春生 馬長(zhǎng)華 韓麗

車前草為車前科Plantaginaceae植物車前Plantago asiatica L．或平車前Plantago depressa wild．的干燥全草，是2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)收載的常用中藥。車前草性寒，味甘，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒之功效，用于水腫尿少、暑濕瀉痢、痰熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥［1］。TANCHAGEM為巴西的常用草藥，根據(jù)《葡漢詞典》［2］，TANCHAGEM 在葡萄牙語(yǔ)中意為車前草，其藥物性狀與功能主治也與中藥車前草類似，但由于巴西各地區(qū)間發(fā)展不平衡，其民族藥的研究開發(fā)往往存在缺少文獻(xiàn)記載、品種混亂、基原不清、品質(zhì)不詳?shù)痊F(xiàn)象［3］。因此，為解決上述質(zhì)量控制中存在的問(wèn)題，本課題組對(duì)巴西草藥TANCHAGEM進(jìn)行全面的質(zhì)量研究，提出了一種新型研究思路“二維特征鑒別法”，即從藥物本身的化學(xué)特征和遺傳學(xué)特征兩方面入手，先采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)藥物的基原進(jìn)行確定，解決“真?zhèn)螁?wèn)題”;再通過(guò)HPLC技術(shù)對(duì)藥物的化學(xué)信息進(jìn)行檢測(cè)，解決“優(yōu)劣問(wèn)題”。

首先采用DNA條形碼技術(shù)并利用ContigExpress軟件，檢索NCBI中注冊(cè)的與巴西草藥相似度最高的物種，以相似度97%以上為物種溯源依據(jù)，確定其基原。其次以車前草的專屬性成分大車前苷為其指標(biāo)成分，利用HPLC法比較巴西草藥TANCHAGEM與中藥車前草中大車前苷的含量，綜合兩者結(jié)果為巴西草藥TANCHAGEM及相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供科學(xué)依據(jù)［4-10］。

1 材料與儀器

1．1 材料

藥材:巴西草藥TANCHAGEM三份(巴西隆城市場(chǎng))，樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室;中藥車前草(北京市花家地南里同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L．的干燥全草)，大車前苷(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào):111833-201102)。試劑:乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)，娃哈哈純凈水，液氮。

1．2 儀器

植物DNA提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司，批號(hào):69691125)、TProfessiona型PCR擴(kuò)增儀(德國(guó) Biometra公司，批號(hào):20092237)、ContigExpress軟件、FW400A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Waters 1525高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、Breeze 2 HPLC色譜工作站，Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 038040柱溫箱、資生堂 C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)。

2 方法與結(jié)果

采用DNA條形碼技術(shù)及HPLC技術(shù)對(duì)巴西草藥TANCHAGEM以及中藥車前草進(jìn)行檢測(cè)分析。

2．1 DNA 條形碼分析

2．1．1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 取巴西樣品，一式三份，分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉，采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物，上游 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3';下游 P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，在 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物 P1和 P4各加2．5 μL(5 μmol/L)，DNA 模板 4 μL，ddH2O16 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，產(chǎn)物均由上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序，以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

圖1 TANCHAGEM的性狀圖

2．1．2 序列分析方法 利用ContigExpress軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接，根據(jù)NCBI中BLAST功能，檢索NCBI中注冊(cè)的相似度最高的物種，按照相似度最高的物種截取ITS全長(zhǎng)。以相似度90%以上為屬的溯源依據(jù)，以相似度97%以上為物種溯源依據(jù)，獲得溯源結(jié)果。

2．2 特征圖譜分析

2．2．1 對(duì)照品及供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備 取大車前苷對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，即得。取樣品粉末(60目)1 g，一式三份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2．2．2 色譜條件 色譜柱:資生堂C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 －0．1%甲酸溶液(17:83);檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;流速:1．0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:30℃。

2．2．3 專屬性考察 按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及各供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液或供試品溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，各色譜圖見圖2。如圖所示，測(cè)定方法專屬性好，待測(cè)成分與其它成分分離度大于1．5，且其他成分對(duì)待測(cè)成分測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 對(duì)照品溶液及各供試品溶液的HPLC圖

2．2．4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面。以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=1445396276687．18X － 182497．06，R2=0.9989。結(jié)果表明，大車前苷在0．1014～4．056 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．2．5 精密度考察 取大車前苷對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。RSD為1．10%，符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定，本法精密度良好。

2．2．6 穩(wěn)定性考察 取中國(guó)車前草樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 小時(shí)，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積。RSD為2．00%，符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定，本法穩(wěn)定性良好。2．2．7 重復(fù)性考察 取中國(guó)車前草樣品，一式6份，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算 RSD值。RSD為1．60%，符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定，表明本法重復(fù)性良好。

2．2．8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份中國(guó)車前草樣品，每份約0．5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的大車前苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率與RSD。結(jié)果表明大車前苷的平均回收率為105．8%，RSD為2．00%，均符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定，表明本法含量測(cè)定結(jié)果良好。見表1。

2．3 結(jié)果

2．3．1 DNA條形碼結(jié)果 3份巴西樣品測(cè)序結(jié)果一致，選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后，經(jīng)BLAST檢索，樣品與車前科車前屬植物相似度最高，相似度范圍為96～99%，因此巴西草藥TANCHAGEM來(lái)自車前科車前屬Plantago L．植物。根據(jù)DNA條形碼相似度達(dá)到99%以上的溯源指標(biāo)，Plantago myosuros、Plantago australis、Plantago virginica、Plantago uniglumis、Plantago trinitatis、Plantago asiatica可能為巴西草藥TANCHAGEM的基原。見圖3～4。2．3．2 大車前苷含量測(cè)定結(jié)果 分別取巴西草藥TANCHAGEM、中藥車前草約1 g，精密稱定，一式三份，按“2．2．1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算待測(cè)成分含量，結(jié)果見表2。

表1 中國(guó)車前草中大車前苷的加樣回收率結(jié)果

圖3 巴西樣品TANCHAGEM的ITS片段圖

圖4 巴西樣品TANCHAGEM的ITS序列BLAST結(jié)果

表2 巴西草藥TANCHAGEM、中國(guó)車前草中大車前苷的含量(n=3)

巴西樣品TANCHAGEM與中藥車前草的特征性譜圖相似度極高，且兩者均含有2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定的車前草指標(biāo)成分大車前苷，巴西車前草中大車前苷含量為0．1025%，中藥車前草中含量為0．1030%，兩者含量接近，均符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定。巴西草藥TANCHAGEM內(nèi)控指標(biāo)符合要求，品質(zhì)優(yōu)良。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用“二維特征鑒別法”，利用中藥DNA條形碼的遺傳學(xué)唯一特性，以及中藥指標(biāo)性成分可量化的特點(diǎn)，對(duì)未知樣品按照先“真?zhèn)巍痹佟皟?yōu)劣”的研究思路進(jìn)行質(zhì)量控制，該法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品基原、指標(biāo)性成分以及相應(yīng)HPLC圖譜的綜合控制，相較于僅考察單一指標(biāo)的傳統(tǒng)質(zhì)控方法，“二維特征鑒別法”能更為全面的反應(yīng)樣品信息。

綜上所述，巴西樣品TANCHAGEM為車前科車前屬Plantago L．植物，其HPLC圖譜與中藥車前草相似度極高，且所含大車前苷含量符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)為下一步是否擴(kuò)大樣本量進(jìn)行采摘和研究巴西車前草提供了參考依據(jù)，同時(shí)也為巴西車前草的質(zhì)量研究、藥用價(jià)值研究、是否引種巴西車前草以及擴(kuò)大中藥資源和應(yīng)用等方面提供了重要依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)(一部)［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:14．

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