董 義，沈才洪，曾 里，黃張君，劉曉碧，劉文虎，何 強(qiáng)，曾凡駿*

（1.四川大學(xué) 食品工程系，四川 成都 610065；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖集團(tuán)，四川 瀘州 646000；3.瀘州老窖集團(tuán)養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000）

0 引言

山藥（Dioscorea opposita），學(xué)名薯蕷，又名山薯、山芋、玉延，為薯蕷科薯蕷屬植物的塊莖，屬于藥食兩用資源.

山藥多糖是山藥中重要的活性物質(zhì)之一，與山藥的增強(qiáng)免疫力、降血糖等眾多保健功能具有一定量效關(guān)系.其結(jié)構(gòu)組成較為復(fù)雜，具有水溶性和醇不溶性特點(diǎn)，一般采用水提醇沉的方式進(jìn)行提取獲得粗多糖.然而，山藥中含有大量淀粉，占干物質(zhì)質(zhì)量的59.12%～78.85%[1]，且與多糖性質(zhì)相似.在提取過(guò)程中如果溫度過(guò)高，則會(huì)有大量淀粉糊化溶解，醇沉后混入粗多糖中，并造成粗多糖量值的虛高[2].另一方面，由于山藥淀粉顆粒的存在，提取溫度低于淀粉糊化溫度時(shí)，淀粉顆粒的包裹阻礙了山藥多糖的釋放，造成山藥多糖提取的不完全.由此作者通過(guò)研究酶解輔助提取山藥多糖工藝，提高了山藥多糖的提取率，為原料資源的充分利用及相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-淀粉酶（3 700 U/g）、糖化酶（10 萬(wàn)U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、碘、碘化鉀等試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為雙蒸水；山藥干粉：山藥飲片打粉，過(guò)40 目篩.

UV-1100 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DSY-1-4 型電熱恒溫水浴鍋：北京愛(ài)琦霞商貿(mào)中心；LD5-2B 型低速離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司.

1.2 試劑準(zhǔn)備

6%苯酚溶液（W/V）：取6.0 g 苯酚加水溶解，定容至100 mL，密封冷藏保存.

0.1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖0.500 0 g 加水溶解，并定容至50 mL，即為10 mg/mL 葡萄糖溶液.取1.0 mL 該溶液，加水稀釋并定容至100 mL.

碘-碘化鉀溶液：稱取碘化鉀3.0 g，加水溶解完全后，加入碘1.0 g，振蕩溶解后定容至100 mL.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)方法

1.3.1.1 粗多糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 分別置于25 mL 具塞比色管中，再加入6%苯酚溶液1 mL、水1.0 mL，混勻.加入12.0 mL 濃硫酸，小心混勻后置于80 ℃中水浴4 min.取出冷卻至室溫后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485 nm 處測(cè)定吸光度.

1.3.1.2 粗多糖含量的測(cè)定

取待測(cè)液100 mL 左右，加入α-淀粉酶0.2 g，混勻，置于60 ℃水浴中45 min，再加入糖化酶15 mg，混勻，60 ℃水浴中45 min 后取出煮沸，待其冷卻后抽濾并收集濾液，準(zhǔn)確吸取濾液（不多于5.0 mL）于離心管中，加入無(wú)水乙醇至25 mL，混勻后置于冰箱中冷藏4 h 以上.取出后以4 000 r/min離心5 min，用膠頭滴管小心吸取20 mL 上清液棄去，再加入20 mL 無(wú)水乙醇洗滌離心兩次后，小心去除上清液，收集沉淀，加水溶解并定容.

取所得溶液1.0 mL 于25 mL 具塞比色管中，按1.3.1.1 中方法添加后續(xù)試劑，并測(cè)定吸光度.所得吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗多糖含量，計(jì)為純粗多糖含量.

1.3.1.3 粗多糖純度的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取待測(cè)液（不多于5.0 mL）于離心管中，加入無(wú)水乙醇至25 mL，混勻后置于冰箱中冷藏4 h 以上.取出后以4 000 r/min 離心5 min，用膠頭滴管小心吸取20 mL 上清液棄去，再加入20 mL 無(wú)水乙醇洗滌離心兩次后，小心去除上清液，收集沉淀，加水溶解并定容.取該溶液1.0 mL 于25 mL 具塞比色管中，按1.3.1.1 中方法添加后續(xù)試劑，并測(cè)定吸光度.所得吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗多糖含量，計(jì)為粗多糖總量.

剩余待測(cè)液按1.3.1.2 中方法測(cè)粗多糖含量，計(jì)為純粗多糖總量.用純粗多糖含量除以粗多糖總量，所得值為粗多糖純度.

1.3.1.4 溶解淀粉的定性判斷

吸取待測(cè)液各3.0 mL，加入碘-碘化鉀溶液2～3 滴，根據(jù)其顏色變化判斷是否有淀粉.

1.3.2 酶解輔助提取工藝優(yōu)化

以α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量、α-淀粉酶酶解時(shí)間、糖化酶酶解時(shí)間作為4 個(gè)單因素分別進(jìn)行考察.各因素變化范圍為：α-淀粉酶添加量為80、100、120、140、160、180、200、220 mg，糖化酶添加量為40、60、80、100、120、140 mg，水浴時(shí)間為30、45、60、75、90 min.

準(zhǔn)確稱取山藥干粉5.00 g，加水100 mL，加入α-淀粉酶，攪拌混勻后，置于60 ℃水浴一定時(shí)間，再加入糖化酶，繼續(xù)水浴一定時(shí)間，完成后取出煮沸.待其冷卻后，以4 000 r/min 離心5 min，收集上清液抽濾并收集濾液.取該濾液3.0 mL 并按1.3.1.4 中所述方法判斷是否溶有淀粉，剩余濾液按1.3.1.3 中方法測(cè)定純粗多糖含量和粗多糖總量，計(jì)算粗多糖的得率及純度.

粗多糖得率=純粗多糖含量×提取液體積÷山藥粉質(zhì)量×100%.

1.3.3 酶解輔助提取多糖工藝與溫水浸提工藝對(duì)比

山藥多糖水浸提液的制備：根據(jù)本試驗(yàn)所得溫水浸提山藥多糖的最優(yōu)工藝進(jìn)行提取.準(zhǔn)確稱取山藥干粉5.00 g，加水150 mL，于70 ℃中水浴30 min 后，離心分離，沉淀再以相同條件提取分離，收集合并兩次上清液抽濾后，減壓濃縮至100 mL，即為山藥多糖水浸提液.

山藥多糖酶解輔助提取液的制備：根據(jù)試驗(yàn)所得酶解輔助山藥多糖的最優(yōu)工藝進(jìn)行提取.

取兩種提取液按1.3.1 中方法分別測(cè)定純粗多糖含量及純度，并按1.3.2 中方法計(jì)算粗多糖得率.

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖檢測(cè)方法

采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚-硫酸法顯色得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示.葡萄糖在0.01～0.1 mg 范圍內(nèi)，吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=0.348 9x-0.004 8，r=0.998 9，y 為吸光度值，x 為0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積.

圖1 苯酚-硫酸法測(cè)粗多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of the polysaccharides using phenol-sulfuric acid determination method

2.2 淀粉的定性判斷

通過(guò)碘溶液判斷淀粉殘留試驗(yàn)結(jié)果得出，各單因素試驗(yàn)中所得酶解輔助提取液碘色反應(yīng)變藍(lán)，即各提取液中均含有淀粉；其各自再經(jīng)酶解純化后的純粗多糖待測(cè)溶液中，碘色反應(yīng)不變藍(lán)，即不含淀粉，內(nèi)容物為純化后的多糖.

2.3 α-淀粉酶添加量對(duì)山藥多糖得率和純度的影響

α-淀粉酶添加量對(duì)山藥多糖得率及純度的影響如圖2 所示.隨著α-淀粉酶添加量的增加，提取液粗多糖得率由2%左右逐漸上升至3%以上.粗多糖純度由30%左右明顯上升至50%以上并保持相對(duì)穩(wěn)定.

圖2 α-淀粉酶添加量對(duì)山藥多糖得率及純度的影響Fig.2 The effect of the α-amylase dosage on the yield and purity of polysaccharides in Chinese yam

由于苯酚-硫酸法的局限性，淀粉在該體系中會(huì)同多糖一樣，經(jīng)硫酸放熱水解成糠醛類化合物，并與苯酚顯色.結(jié)合提取液中碘色反應(yīng)與圖2 可知，經(jīng)過(guò)酶解輔助提取過(guò)程，山藥中淀粉并未完全酶解糖化，所得的山藥提取液中仍有部分淀粉混入，以該液直接采用醇沉苯酚硫酸顯色所得粗多糖總量中，有淀粉混入所致的虛高；經(jīng)過(guò)精制酶解去除淀粉后所測(cè)得的粗多糖含量，為除去了淀粉的純多糖，其與粗多糖總量之比即為提取液中粗多糖的純度.由圖2 可知，隨著α-淀粉酶添加量的增加，粗多糖的溶出也逐漸增加并保持在一定區(qū)間內(nèi)，而混入提取液中的淀粉量逐漸下降至較為平穩(wěn)的狀態(tài)，即提取液中粗多糖的純度有明顯提高并保持穩(wěn)定.α-淀粉酶添加量在0.16%左右時(shí)，山藥中粗多糖的釋放量達(dá)到最大值，純度也最高，混入的淀粉量最少.

2.4 糖化酶添加量對(duì)山藥多糖得率和純度的影響

糖化酶添加量對(duì)山藥多糖得率及純度的影響如圖3 所示.隨著糖化酶添加量的增加，提取液粗多糖得率由5%逐漸下降至3.5%左右.粗多糖純度由40%左右明顯上升至60%以上并保持相對(duì)穩(wěn)定.

由圖3 可知，隨著糖化酶添加量的增加，粗多糖的得率逐漸降低并保持在一定區(qū)間內(nèi)即粗多糖在一定程度上會(huì)被糖化酶酶解而精制，剩余為對(duì)酶解反應(yīng)穩(wěn)定的純多糖；而混入提取液中的淀粉量迅速下降，即提取液中粗多糖的純度有明顯提高.在糖化酶添加量為0.12%左右時(shí)，山藥中粗多糖的得率達(dá)到較穩(wěn)定狀態(tài)，純度較高，混入的淀粉量較少.

圖3 糖化酶添加量對(duì)山藥多糖得率及純度的影響Fig.3 The effect of the saccharifying enzyme dosage on the yield and purity of polysaccharides in Chinese yam

2.5 α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率和純度的影響

α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率及純度的影響如圖4 所示.隨著α-淀粉酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液粗多糖得率由5%左右逐漸下降至4%左右.粗多糖純度由60%以下緩慢上升至60%以上并保持相對(duì)穩(wěn)定.

圖4 α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率及純度的影響Fig.4 The effect of the α-amylase hydrolysis time on the yield and purity of polysaccharides in Chinese yam

由圖4 可知，隨著α-淀粉酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖的得率與純度均逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，即山藥中粗多糖的釋放逐漸達(dá)到最大值，對(duì)混入淀粉的消除均逐漸達(dá)到最優(yōu)的平穩(wěn)狀態(tài).即在α-淀粉酶酶解時(shí)間60 min 左右時(shí)，山藥中粗多糖的得率達(dá)到較穩(wěn)定狀態(tài)，山藥淀粉得到了最大程度的水解去除，粗多糖純度較高，混入的淀粉量較少.

2.6 糖化酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率和純度的影響

糖化酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率及純度的影響如圖5 所示.隨著糖化酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液粗多糖得率由5%以上逐漸下降至4%左右.粗多糖純度維持在60%以上并保持在較小區(qū)間內(nèi).

由圖5 可知，隨著糖化酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖的得率與純度均逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài).由于糖化酶的作用為繼續(xù)水解淀粉酶水解出的淀粉支鏈片段，則其反應(yīng)時(shí)間對(duì)于溶解淀粉的含量及粗多糖得率的變化較為不明顯，可能對(duì)真正的多糖有過(guò)度水解作用，從而使得粗多糖得率降低.即在糖化酶酶解時(shí)間60 min 時(shí)，山藥中粗多糖的得率達(dá)到較為穩(wěn)定狀態(tài)，且被過(guò)度水解部分不多，山藥淀粉得到了最大程度的水解去除，粗多糖純度較高，混入的淀粉量較少.

圖5 糖化酶酶解時(shí)間對(duì)山藥多糖得率及純度的影響Fig.5 The effect of the saccharifying enzyme hydrolysis time on the yield and purity of polysaccharides in Chinese yam

綜合前面各單因素試驗(yàn)結(jié)果可得出酶解輔助提取山藥多糖的最優(yōu)工藝為：以含山藥原料質(zhì)量濃度5%的提取溶劑計(jì)，α-淀粉酶添加量為0.16%，淀粉酶酶解時(shí)間為60 min，糖化酶添加量為0.12%，糖化酶酶解時(shí)間為60 min.

2.7 酶解輔助提取多糖工藝與溫水浸提工藝對(duì)比

根據(jù)前面所得酶解輔助提取最優(yōu)工藝，提取所得粗多糖與溫水浸提粗多糖，在得率及純度方面的對(duì)比結(jié)果如圖6 所示.

由圖6 可知，酶解輔助提取工藝粗多糖得率為4.36%，溫水浸提工藝得率為1.23%.即在酶解輔助下，粗多糖的得率提高了2.5 倍左右；酶解輔助提取的多糖純度為61.02%，較溫水浸提工藝所得多糖純度高30 個(gè)百分點(diǎn)，提高了1 倍左右.

圖6 酶解輔助提取工藝與溫水浸提工藝粗多糖得率及純度的對(duì)比Fig.6 The comparison of the enzymolysis-assistant extracting method and normal immersing extracting method on the yield and purity of polysaccharides in Chinese yam

3 結(jié)論

山藥的提取目前多為水提，受限于較低的水提溫度和淀粉的干擾，山藥多糖的得率、純度并不高，由浸提所測(cè)得的山藥多糖含量也相對(duì)較低，為2.15%～2.92%[3].且由于檢測(cè)方法的局限性，其所測(cè)得的山藥多糖含量會(huì)由于混有淀粉而偏高.曾凡梅等[4]則采用了超聲波協(xié)同纖維素酶解共同輔助提取山藥多糖，使其多糖得率達(dá)到2.48%.但其所得多糖的純度并未測(cè)定，其多糖檢測(cè)方法沒(méi)有排除淀粉混入帶來(lái)的干擾.張衛(wèi)明等[2]在測(cè)定山藥中粗多糖含量時(shí)采用了淀粉酶進(jìn)行輔助提取，并對(duì)比了溫水浸提和開(kāi)水煮提所得結(jié)果，得出與本試驗(yàn)相似的結(jié)論，即開(kāi)水煮提會(huì)使淀粉溶出導(dǎo)致多糖值的虛高，溫水浸提則得率過(guò)低，酶解法則能較為準(zhǔn)確地反映出山藥多糖的含量，其得出多糖含量為3.53%.但該文未對(duì)酶解所得山藥多糖的純度進(jìn)行進(jìn)一步研究，也未對(duì)酶解輔助提取工藝進(jìn)行深入探索.在本試驗(yàn)中，將淀粉酶、糖化酶運(yùn)用到了對(duì)多糖的輔助提取中，從多糖得率和多糖純度兩方面，與普通水浸提工藝進(jìn)行了對(duì)比研究.從產(chǎn)物山藥多糖方面來(lái)看，酶解輔助提取工藝無(wú)論從得率還是純度上，都較普通水浸提有明顯優(yōu)勢(shì).從工藝條件方面來(lái)看，兩種提取方式在溶劑消耗、時(shí)間消耗和工藝復(fù)雜性上各有優(yōu)缺點(diǎn).綜合產(chǎn)物及工藝兩方面對(duì)比結(jié)果認(rèn)為，酶解輔助有助于山藥多糖的提取，該工藝優(yōu)于普通水浸提工藝.

采用α-淀粉酶、糖化酶輔助提取山藥多糖，得率明顯提高的原因可能與山藥中淀粉顆粒有關(guān).山藥中淀粉顆粒外形隨品種不同而有很大的差異，顆粒平均粒徑最大為36.96 μm，最小為23.39 μm[5]，整體平均粒徑小于馬鈴薯淀粉，且呈圓形、橢圓形、不規(guī)則的多角形和立方形等多種形態(tài)，淀粉顆粒表面光滑無(wú)裂痕[6].山藥多糖的多級(jí)結(jié)構(gòu)與淀粉顆粒在空間上可能有一定交叉，且淀粉顆?？赡軐?duì)山藥多糖形成包裹狀態(tài).采用單純水浸提，不破除淀粉顆粒包裹束縛，山藥多糖則無(wú)法完全釋放；而經(jīng)過(guò)淀粉酶、糖化酶的酶解，淀粉顆粒破裂，促進(jìn)了山藥多糖的溶出，從而達(dá)到了輔助提取的目的.同時(shí)，經(jīng)過(guò)淀粉酶、糖化酶的初步酶解，對(duì)混入提取液中的淀粉也進(jìn)行了有效地清除，大大提高了所得提取液中粗多糖的純度.

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［2］張衛(wèi)明，單承鶯，杭悅宇，等.溫度因素對(duì)薯蕷多糖測(cè)定的影響研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（5）：393-395.

［3］王震宙，黃紹華.山藥中的功能保健成分及其在食品加工中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2004（4）：51-52.

［4］曾凡梅，張恒，孔明航.超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測(cè)定研究［J］.江西食品工業(yè)，2010（2）：32-39.

［5］王旭.山藥淀粉改性及山藥蛋白復(fù)合物的研究［D］.天津：天津大學(xué)，2008.

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