姜 萍， 劉 鑫， 蕭 偉， 丁 崗， 趙林果

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)活性成分·

巨尾桉葉中原花色素提取工藝比較及不同溶劑萃取物生物活性的研究

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001)

通過(guò)正交試驗(yàn)探討了巨尾桉葉中原花色素的3種提取方法的最佳提取工藝條件，并進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)溶劑提取法的最優(yōu)工藝為：60%乙醇、80 ℃、100 min、料液比1 ∶14(g ∶mL，下同)，原花色素得率5.95%；微波輔助提取法的最優(yōu)工藝為:50%乙醇、微波功率200 W、微波時(shí)間4 min、料液比為1:20，得率5.48%；超聲波輔助提取法的最優(yōu)工藝為：60%乙醇、60 ℃、超聲波時(shí)間25 min、料液比為1 ∶14，得率為6.07%。超聲波輔助提取法效果最好，時(shí)間短，得率高。實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波提取物的不同溶劑萃取物體外抗氧化性和抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物抗氧化作用較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 g/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到96.33%；乙酸乙酯萃取物質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，對(duì)于人肝癌細(xì)胞Bel-7404具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性,抑制率為56.37%。

巨尾桉；原花色素；提取工藝；抗氧化和抗腫瘤

桉樹(shù)是桃金娘科桉屬植物的統(tǒng)稱(chēng)，天然分布于澳大利亞大陸及華萊士線以東島嶼等地區(qū)。桉樹(shù)植物主要有巨尾桉、藍(lán)桉和檸檬桉等。目前對(duì)桉葉油的化學(xué)成分、藥理作用及其機(jī)理做了多方面的分析和研究[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)巨尾桉葉是一種富含原花色素的植物資源。原花色素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、預(yù)防或抑制腫瘤、預(yù)防或治療冠心病和中風(fēng)等心腦血管疾病的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、日用化學(xué)品以及保健品等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。原花色素的提取一般采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑和水提取法。微波輔助提取法以及超聲波輔助提取法用于巨尾桉中原花色素的提取的研究報(bào)道很少[7-9]。本研究針對(duì)巨尾桉葉中原花色素的不同提取方法的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)巨尾桉葉中超聲波輔助提取的不同溶劑萃取物的體外抗氧化活性和抗腫瘤活性進(jìn)行了初步研究，旨在能開(kāi)發(fā)出一種天然的抗氧化劑和抗腫瘤藥劑，為巨尾桉葉的綜合利用開(kāi)辟一條新的途徑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 新鮮巨尾桉葉，采自廣西南寧七坡林場(chǎng)，原料風(fēng)干，粉碎粒度為0.63 mm。4-(二甲胺基)肉桂醛，Sigma-Aldrich公司；原花青素A2，Chroma公司。其它提取溶劑和分析試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度儀，日本SHIMADZU公司；KH-800KDB型高功率數(shù)控超聲波儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；MAS-I型常壓微波輔助合成/萃取反應(yīng)儀，新儀微波化學(xué)科技有限公司；Spectra Max Plus 微盤(pán)讀數(shù)器，分子儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)溶劑浸提法 準(zhǔn)確稱(chēng)取已粉碎的巨尾桉葉原料5.00 g，裝入250 mL圓底燒瓶中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑，在不同的提取溫度、提取時(shí)間、料液比(g ∶mL，下同)、提取1次的條件下，進(jìn)行熱浸提、過(guò)濾、定容至250 mL。用于測(cè)定原花色素的含量，并計(jì)算得率。

1.2.2 微波輔助提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取已粉碎的原料5.00 g，裝入250 mL長(zhǎng)頸圓底燒瓶，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑，在不同的微波輻射時(shí)間、料液比、微波功率、浸提1次的條件下，進(jìn)行微波提取、過(guò)濾、定容至250 mL。用于測(cè)定原花色素含量。

1.2.3 超聲波輔助提取法 準(zhǔn)確稱(chēng)取已粉碎的原料5.00 g，裝入250 mL圓底燒瓶中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑，超聲功率200 W，在不同的提取溫度、超聲時(shí)間、料液比、浸提1次的條件下，進(jìn)行超聲波提取、過(guò)濾、定容至250 mL。用于測(cè)定原花色素含量。

1.3 總原花色素的含量分析方法

1.3.1 分析方法 4-(二甲胺基)肉桂醛(DMAC)與原花青素(PAC)的反應(yīng)形成一個(gè)有顏色的物質(zhì)，在640 nm處測(cè)吸光度，對(duì)PAC進(jìn)行定量[10]。

1.3.2 0.1%DMAC溶液配制 用酸化乙醇溶解0.05 g DMAC，在50 mL容量瓶中進(jìn)行定容。試劑穩(wěn)定在-20 ℃至少9天。試劑是光敏感性的，用鋁箔保護(hù)。

1.3.3 PAC標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/L。

1.3.4 測(cè)試步驟 分別加63 μL的水空白樣、各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和稀釋樣品于96孔板不同的孔中。所有樣品都是一式3份。用多孔移液器吸取189 μL DMAC溶液加到每一個(gè)孔中，并混合。將盤(pán)放入Molecular Devices 儀器中，波長(zhǎng)為640 nm，利用softmax pro軟件程序測(cè)定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出總原花色素的含量。按下式計(jì)算總原花色素得率。

R=CV/W×10-6×100%

式中:R—總原花色素得率，%;C—原花色素質(zhì)量濃度，mg/L;V—待測(cè)提取溶液的總體積，mL;W—原料的質(zhì)量，g。

1.4 不同溶劑萃取抗氧化活性試驗(yàn)

1.4.1 樣品的制備 精確稱(chēng)取已粉碎的巨尾桉葉原料50.00 g于1 000 mL圓底燒瓶中，加600 mL 95%乙醇在60 ℃水浴中超聲回流提取30 min，過(guò)濾，濾液真空濃縮除去乙醇，將濃縮后的溶液分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水的4種萃取物(已除去溶劑)。再分別配成質(zhì)量濃度為0.24、0.48、0.72、0.96和1.20 g/L乙醇溶液，備用。

1.4.2 樣品抗氧化活性的測(cè)定 分別精確量取不同質(zhì)量濃度的各樣品乙醇溶液各1.0 mL，置于10 mL離心管中，加入3.0 mL的0.08 mmol/L DPPH乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，同時(shí)以同樣方法處理的無(wú)水乙醇為空白，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

R=[A0-(AS-AC)]/A0×100%

式中:R—清除率，%;A0—1.0 mL無(wú)水乙醇+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;AS—1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;AC—1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無(wú)水乙醇的吸光度值。

將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求得清除率的平均值。

1.5 不同溶劑萃取物抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 樣品的制備 取1.4.1節(jié)中的4種萃取物，以二甲基亞砜為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為200、20和2 g/L樣品溶液。

1.5.2 抗腫瘤MTT方法實(shí)驗(yàn) 取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)2×104～4×104個(gè)/mL，制成細(xì)胞懸液。然后取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，每孔180 μL，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換液，加入受試藥物，每孔20 μL，培養(yǎng)72 h。MTT試劑加入96孔板中，每孔20 μL，培養(yǎng)箱中反應(yīng) 4 h。吸出上清液，加入DMSO，每孔150 μL，平板搖床上振搖5 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定每孔的吸光值，并通過(guò)下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

質(zhì)量濃度分別為200、20和2 g/L，如果抑制率都大于50%，表示有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。其中有2個(gè)濃度的樣品抑制率大于50%，表示有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。其中有1個(gè)濃度的樣品抑制率大于50%，表示有較弱的抗腫瘤活性。其中3個(gè)濃度的樣品抑制率都小于50%，表示沒(méi)有抗腫瘤活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法條件優(yōu)化及比較

2.1.1 傳統(tǒng)溶劑浸提法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、提取溫度(D)做4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)，以提取得到的巨尾桉葉中總原花色素含量為考察指標(biāo)，確定提取優(yōu)化工藝條件。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 傳統(tǒng)溶劑浸損法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of orthogonal test for traditional solvent extraction

由表1可知，各因素對(duì)提取率影響的順序?yàn)镈>A>B>C，最好的試驗(yàn)方案為A1B1C2D3，即提取溫度為80 ℃，60%乙醇為溶劑，提取時(shí)間為100 min，料液比為1 ∶14。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得總原花色素得率為5.95%。

2.1.2 微波輔助提取法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了提取次數(shù)，選出乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、微波功率(B)、微波提取時(shí)間(C)、料液比(D)做4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)，以提取得到的巨尾桉葉中總原花色素含量為考察指標(biāo)，確定提取優(yōu)化工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 微波輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test for microwave-assisted extraction

由表2可知，各因素對(duì)提取率影響的順序?yàn)锳>D>B>C，最好的試驗(yàn)方案為A2B2C1D2，即50%乙醇為溶劑，微波功率200 W，微波提取時(shí)間為4 min，料液比為1 ∶20。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得總原花色素得率為5.48%。

2.1.3 超聲波輔助提取法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了提取次數(shù)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)做4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)，以提取得到的巨尾桉葉中總原花色素含量為考察指標(biāo)，確定提取優(yōu)化工藝條件，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test for ultrasonic-assisted extraction

由表3可知，各因素對(duì)提取率影響的順序?yàn)镃>D>A>B，最好的試驗(yàn)方案為A2B2C2D1，即60%乙醇為溶劑，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間為25 min，料液比為1 ∶14。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總原花色素得率為6.09%。

2.1.4 3種提取方法比較 實(shí)驗(yàn)原料各5 g，分別采用溶劑浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法以?xún)?yōu)化后的最佳工藝條件提取巨尾桉葉中的總原花色素，并用分光光度法測(cè)定提取物中原花色素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。采用3種不同的提取方法并在最佳的工藝條件下對(duì)巨尾桉葉中的原花色素類(lèi)化合物進(jìn)行提取，由表4可以看出，傳統(tǒng)溶劑浸提法和微波輔助提取法對(duì)總原花色素提取率均小于超聲波輔助提取法。微波和超聲波輔助提取法相對(duì)于溶劑浸提法都有較大優(yōu)勢(shì)，微波輔助提取法具有提取時(shí)間短，高效、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。而超聲波輔助提取法的得率高，可避免高溫對(duì)提取活性成分的影響等優(yōu)勢(shì)。

表4 3種提取方法提取工藝的比較Table 4 Comparison of extraction technology of three extraction methods

2.2 不同溶劑萃取物的體外抗氧化活性

圖1 巨尾桉葉中不同溶劑萃取物的體外抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of different solvent extracts

運(yùn)用超聲波輔助提取法對(duì)巨尾桉葉進(jìn)行提取，用于測(cè)定巨尾桉葉中不同溶劑萃取物的體外抗氧化活性，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著樣品溶液濃度增加，對(duì)DPPH·清除率都逐漸增強(qiáng)；但石油醚萃取液對(duì)DPPH·清除率增加不明顯；乙酸乙酯萃取液在質(zhì)量濃度大于0.48 g/L時(shí)，對(duì)DPPH·清除率已超過(guò)90%以上；其次水萃取物質(zhì)量濃度大于0.96 g/L時(shí)，對(duì)DPPH·清除率超過(guò)90%。在較低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)時(shí)，乙酸乙酯萃取液就有很大清除率，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 g/L時(shí)，對(duì)DPPH·清除率達(dá)到最大值為96.33%。所以，巨尾桉葉中不同溶劑萃取物的體外抗氧化活性中，乙酸乙酯萃取液體外抗氧化活性最強(qiáng)。

2.3 不同溶劑萃取物的體外抗腫瘤活性

運(yùn)用超聲波輔助提取法對(duì)巨尾桉葉進(jìn)行提取，然后用4種不同溶劑萃取得到萃取物，并對(duì)人肺腺癌細(xì)胞H460及人肝癌細(xì)胞Bel-7404進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，并與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣品抗腫瘤活性進(jìn)行比較。結(jié)果如表5所示。

表5 抗腫瘤活性結(jié)果分析Table 5 Results of anti-tumor activity

注：“+++”表示強(qiáng)效indicate best effect，“++”表示中效indicate better effect，“+”表示弱效indicate weak effect

由表5可以看出：在2 g/L 的低質(zhì)量濃度下，對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7404 的抑制率可達(dá)到56.37%，說(shuō)明其對(duì)于人肝癌細(xì)胞Bel-7404具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。其次氯仿萃取物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞H460和人肝癌細(xì)胞Bel-7404也有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。而水萃取物和石油醚萃取物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞H460和人肝癌細(xì)胞Bel-7404的抗腫瘤活性較低。

3 結(jié) 論

3.1 對(duì)比研究了從巨尾桉葉中提取總原花色素類(lèi)化合物的3種提取方法，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出3種不同提取方法的最佳工藝條件。傳統(tǒng)溶劑提取法：以60%乙醇為溶劑，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為100 min，料液比為1 ∶14，巨尾桉葉的總原花色素得率為5.95%；微波輔助提取法：5 g原料以50%濃度的乙醇作為溶劑，微波功率200 W，微波時(shí)間為4 min，料液比為1 ∶20，得率5.48%；超聲波輔助提取法：以60%乙醇為溶劑，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間為25 min，料液比為1 ∶14，得率為6.09%。將3種提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明超聲波輔助提取法效果最好。

3.2 巨尾桉葉不同溶劑萃取物對(duì)DPPH·都有一定清除效果，尤其乙酸乙酯萃取物體外抗氧化活性最強(qiáng),質(zhì)量濃度1.2 g/L時(shí)對(duì)DPPH·清除率達(dá)到96.33%。巨尾桉葉中的化學(xué)成分具有很強(qiáng)的抗氧化作用，是一種天然的抗氧化劑，為巨尾桉的綜合利用開(kāi)辟一條新的途徑。并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物對(duì)于人肝癌細(xì)胞Bel-7404具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，質(zhì)量濃度為2 g/L，對(duì)人肺腺癌細(xì)胞H460的抑制率為49.46%，對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7404的抑制率為56.37%。

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Extraction Technology of Proanthocyanidins from Urophylla Leaves and Biological Activities of Different Solvent Extracts

JIANG Ping1, LIU Xin1, XIAO Wei2, DING Gang2, ZHAO Lin-guo1

(1.College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Jiangsu KangYuan Pharmaceutical Co.,Ltd., Lianyungang 222001, China)

The optimum extraction conditions of proanthocyanidins from urophylla leaves using three extraction methods were investigated by using orthogonal experiment.The extracted results were compared.Then,vitro antioxidant and anti-tumor activities of different solvent extracts from ultrasonic extracts were studied.The optimum crafts for traditional solvent extraction method were 60% ethanol,80 ℃,100 min,ratio of material-liquid 1 ∶14(g ∶mL,the same below),and the obtained yield of proanthocyanidin was 5.95%.The optimum crafts for microwave-assisted extraction were 50% ethanol,microwave power 200 W,4 min for each time,ratio of material-liquid 1 ∶20 with the yield of proanthocyanidin 5.48%.And the optimum crafts for ultrasonic extraction method were 60% ethanol,60 ℃,ultrasonic time 25 min,ratio of material-liquid 1 ∶14,and the yield of proanthocyanidin was 6.07%.Ultrasonic assisted extraction worked best,due to the short extract time and the high yield.The results of antioxidant test showed that the ethyl acetate extracts from ultrasonic extracts exhibited the highest antioxidant activity,as well as the maximum of DPPH radical scavenging ratio was 96.33% with the concentration of 1.2 g/L among different solvent extracts.Experimental results of antitumor activity of different solvent extracts showed that the ethyl acetate extract possessed highest antitumor activity for human hepatoma cell Bel-7404 with the concentration of 2 g/L,and the inhibition rate was 56.37%.

urophylla;proanthocyanidins;extraction technology;antioxidant and antitumor activity

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.04.004

2015-04-15

廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心基金項(xiàng)目(2013A03)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(無(wú)編號(hào))

姜 萍(1969—)，女，黑龍江伊春人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用；E-mail:pingjiang07@hotmail.com

*通訊作者：蕭 偉，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新品種、新工藝和新劑型的開(kāi)發(fā)與研究;E-mail:xw@kanion.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)04-0019-06