谷苗苗, 王尉嘉, 王 迪, 周愛東

(1. 南京大學(xué) 金陵學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210089;2. 南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210093)

紫外分光光度法測(cè)定可樂中咖啡因含量樣品前處理方法探討

谷苗苗, 王尉嘉1, 王 迪1, 周愛東2

(1. 南京大學(xué) 金陵學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210089;2. 南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210093)

探討了使用紫外分光光度法測(cè)定可樂中咖啡因含量過程中樣品經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后,由于離心分離或靜置不充分而產(chǎn)生吸光度增加的原因。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證萃取后離心(靜置)步驟的必要性,比較了干燥、離心、靜置和靜置后離心4種前處理方法的相對(duì)誤差,結(jié)果表明:離心分離可以減少水滴散射帶來的誤差,快速達(dá)到靜置的效果并且節(jié)約時(shí)間,離心分離是最佳的樣品前處理方式。

紫外分光光度法; 咖啡因; 離心分離; 樣品前處理

咖啡因(C8H10N4O2)是從茶葉、咖啡果中提煉出來的一種甲基黃嘌呤的生物堿。它是一種中樞神經(jīng)興奮劑,適量食用咖啡因有祛除疲勞、興奮神經(jīng)等作用,臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇,但是大劑量或長(zhǎng)期使用有損人體健康[1]。在通常的飲料如咖啡、茶和可樂以及頭痛藥、止疼藥中都發(fā)現(xiàn)有咖啡因的存在[2]。目前飲料中咖啡因的檢測(cè)方法有:紫外分光光度法[3]、氣相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用[5]、高效液相色譜法[6]、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法[7]、二階導(dǎo)數(shù)光譜法[8-9]、咖啡因離子選擇性電極[10]、氮蒽橙法[11]、HPLC-ES-MS法[12]等。

為培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)和科學(xué)研究能力[13],我校在儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引入設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):采用紫外分光光度法測(cè)定可樂中咖啡因含量時(shí),同種可樂用三氯甲烷萃取后隨靜置時(shí)間的增加,吸光度值明顯減小而后趨于穩(wěn)定。本文深入研究了吸光度差異產(chǎn)生的原因，以及使用紫外分光光度法測(cè)定可樂中咖啡因含量時(shí)萃取之后靜置或離心分離步驟的必要性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器有紫外分光光度計(jì)(UV22401PC)、超聲儀。

試劑有咖啡因、三氯甲烷、無水硫酸鈉，所用試劑均為分析純，可樂飲料(市售)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

咖啡因儲(chǔ)備液配制:準(zhǔn)確稱取51.07 mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)樣品,用三氯甲烷定容至50 mL,得到1.021 g/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品萃取

取可樂飲料20～30 mL于50 mL燒杯中，超聲脫氣5 min除去CO2,準(zhǔn)確取200L注入10 mL離心管中，加入4 mL三氯甲烷進(jìn)行萃取,振搖2min,備用[2]。

2 結(jié)果與討論

2.1 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在200～400 nm范圍內(nèi)掃描,得到咖啡因最大吸收波長(zhǎng)為276.1 nm。圖1為在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)得的結(jié)果,咖啡因吸光度A-質(zhì)量濃度c標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.045 6x+0.028,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,表明咖啡因在1.0～40.0 mg/L范圍內(nèi)咖啡因吸光度-濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 吸光度-咖啡因濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液模擬萃取-靜置實(shí)驗(yàn)

首先取20 g/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液,在波長(zhǎng)276.1 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0，A0=1.045。其次將20 mg/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)三氯甲烷萃取劑(咖啡因溶液與萃取劑的體積比為1∶20時(shí),三氯甲烷一次萃取效率可達(dá)99.67%[2])充分混合后,迅速將該濁液倒入比色皿中,每隔一段時(shí)間記錄一次吸光度值,并繪制吸光度-時(shí)間曲線(見圖2)。從圖2中可以看出,混合后剛開始的10 min內(nèi)吸光度不穩(wěn)定,一定時(shí)間后吸光度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,最后趨于穩(wěn)定,若取穩(wěn)定后的吸光度值A(chǔ)靜置進(jìn)行計(jì)算,則A靜置=0.991,與A0比較相差不大。

圖2 標(biāo)液模擬萃取-靜置實(shí)驗(yàn)吸光度-時(shí)間曲線

然后將比色皿重新震搖后,再次測(cè)得其吸光度值為1.129,放置一段時(shí)間后吸光度值又下降。此現(xiàn)象是由于有機(jī)相里的小水滴對(duì)光產(chǎn)生了散射,導(dǎo)致吸光度的上升,靜置使有機(jī)相里的小水滴減少,對(duì)光的散射減弱,吸光度最終降到正常水平。因此靜置是必要的,否則小水滴不能完全分離,使測(cè)得的吸光度偏大。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液模擬萃取-離心分離實(shí)驗(yàn)

20 mg/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)三氯甲烷萃取后以2 500 r/min離心10 min,取下層清液測(cè)定吸光度值，測(cè)得A離心=1.059,與A0相差不大。可見,離心分離也可以減少小水滴散射帶來的誤差,并且節(jié)約時(shí)間。

2.4 可樂樣品萃取-靜置實(shí)驗(yàn)

可口可樂樣品萃取-靜置實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 可口可樂樣品萃取-靜置實(shí)驗(yàn)吸光度-時(shí)間曲線

由圖3可以看出,可口可樂樣品萃取后在靜置過程中吸光度也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因分析如下:當(dāng)一束光照射在介質(zhì)上時(shí),會(huì)激起其中的電子作受迫振動(dòng),從而發(fā)出相干的次波。如果該介質(zhì)在光波長(zhǎng)(10-7m)尺度上分布均勻時(shí),次波相干疊加會(huì)導(dǎo)致次波相消,只剩下遵循幾何光學(xué)規(guī)律的光線;如果該介質(zhì)不均勻,即在區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)有較大差異時(shí),次波無法相消,于是就形成了散射光[14]。散射體尺度小于入射光波長(zhǎng),則適用于瑞利散射;若散射體較大,則遵從米氏散射。不均勻團(tuán)塊的尺度遠(yuǎn)大于波長(zhǎng)的數(shù)量級(jí)時(shí),散射光又可以看成在這些團(tuán)塊上的反射和折射[14]。散射會(huì)使光在原來傳播方向上的光強(qiáng)減弱,遵從如下指數(shù)規(guī)律[14]:I=I0e-(αa+αs)l=I0e-αl，式中:aa是吸收系數(shù),αs是散射系數(shù)，兩者之和α稱為衰減系數(shù),它表征光通過介質(zhì)時(shí)因介質(zhì)的吸收和散射的共同作用而使光強(qiáng)減弱的程度[15]。

用有機(jī)溶劑對(duì)咖啡因萃取后,如果靜置或離心分離不充分,則會(huì)有各種尺度的小水滴分散在有機(jī)相中,形成散射體，使通過介質(zhì)的光強(qiáng)度減弱,使得吸光度增加,造成測(cè)量不準(zhǔn)確。

2.5 樣品處理方式的選擇

為了消除萃取時(shí)有機(jī)相中少量的水分的影響一般可采取4種方式:即干燥、離心、靜置、干燥后離心。

(1) 干燥:取4mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.42mg/L),加200L蒸餾水震蕩3min,靜置幾秒移去上層明顯水滴,然后用無水硫酸鈉干燥,再用微孔濾膜過濾測(cè)其吸光度。

(2) 離心:取4mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.42mg/L),加200L蒸餾水震蕩3min,靜置幾秒移去上層明顯水滴,然后2 500r/min離心3min,吸取下層測(cè)其吸光度。

(3) 靜置:取4mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.42mg/L),加200L蒸餾水震蕩3min,靜置幾秒移去上層明顯水滴后靜置40min,測(cè)其下層溶液吸光度。

(4) 干燥后離心:取4mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.42mg/L),加200L蒸餾水震蕩3min,靜置幾秒移去上層明顯水滴,用無水硫酸鈉干燥,再用微孔濾膜過濾,然后2 500r/min離心3min,吸取下層測(cè)其吸光度。

測(cè)得的4種樣品處理方式吸光度值和相對(duì)誤差值(與標(biāo)準(zhǔn)液濃度10.42mg/L相比)見表1。

表1 不同樣品處理方式的吸光度值和相對(duì)誤差

由表1數(shù)據(jù)表明:靜置的相對(duì)誤差120%,是4種前處理方法中最大的,可能是因?yàn)閷悠酚呻x心管轉(zhuǎn)移到比色皿中時(shí)受到震蕩,使其吸光度升高,但是其后吸光度是有下降趨勢(shì)的。

加入無水硫酸鈉干燥相對(duì)誤差較大，可能是無水硫酸鈉除去了小液滴,同時(shí)引入固體顆粒。雖然使用了微孔濾膜過濾,但除去直徑較小的固體顆粒依然存在困難,同樣產(chǎn)生散射,使吸光度升高,回收率升高。

3 結(jié)論

由于萃取后靜置或離心分離不充分,導(dǎo)致樣品中的水分散在三氯甲烷中形成細(xì)小的水滴,這種水滴對(duì)光產(chǎn)生散射,使吸光度增大。離心可以有效地消除有機(jī)相中小水滴散射的影響?？蓸窐悠非疤幚頃r(shí),使用有機(jī)相萃取后只需離心處理就可以達(dá)到檢測(cè)要求。使用離心分離處理后測(cè)得市售某批次常規(guī)可口可樂中咖啡因含量為96.4 mg/L,百事可樂中咖啡因含量為104.8 mg/L。

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Discussion of pretreatment steps of determination of caffeine content in cola beverages with ultraviolet spectrophotometry method

Gu Miaomiao1, Wang Weijia1, Wang Di1, Zhou Aidong2

(1. School of Chemistry and Life Sciences,Nanjing University Jinling College, Nanjing 210089,China;2. School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210093, China)

In this work,the reasons why the absorption of the UV light became higher after extraction by the organic solvents when testing the caffeine content in colas in the method of ultraviolet spectrophotometry are discussed,and this phenomenon was caused by the insufficiency of centrifugal separation or still standing.The necessity of centrifugal separation (or still standing)after extracting is explained based on the experiment.Also,the recovery rates of the four pretreatment methods including drying,centrifugal separation,still standing and centrifugal separation after still standing are compared. The centrifugal separation is the best way of pretreatment, which could reduce the error caused by scattering droplets,achieve the static effect quickly and save time.

ultraviolet spectrophotometry method; caffeine; centrifugal separation; sample pretreatment

2014- 12- 11 修改日期：2014- 12- 28

2013年江蘇省高等教育教改研究項(xiàng)目(2013JSJG168)

谷苗苗(1982—)，女，山東萊蕪，碩士，講師，主要從事儀器分析教學(xué)及實(shí)驗(yàn)室管理工作

E-mail：gumiaomiao@yeah.net

周愛東(1973—)，男，江蘇淮安，博士，副教授，主要從事傳質(zhì)與分離研究及實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理.

E-mail：zhouad@nju.edu.cn

G642.0;TS275

B

1002-4956(2015)6- 0042- 03