王麗紅， 姜曉婷， 劉 暢， 姜春玲， 譚鳳田， 梅思琪

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江省第三醫(yī)院，黑龍江黑河 164000；3.江蘇萬邦醫(yī)藥營(yíng)銷有限公司，江蘇徐州 221004)

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烏蘇里瓦韋抑菌作用研究

王麗紅1， 姜曉婷1， 劉 暢2， 姜春玲1， 譚鳳田3， 梅思琪1

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江省第三醫(yī)院，黑龍江黑河 164000；3.江蘇萬邦醫(yī)藥營(yíng)銷有限公司，江蘇徐州 221004)

[目的]探討烏蘇里瓦韋的抑菌作用。[方法]以烏蘇里瓦韋為研究對(duì)象，在單因素的基礎(chǔ)上，選用Na+濃度、蔗糖濃度、不同的有機(jī)溶劑萃取物，采用正交試驗(yàn)的原理，研究烏蘇里瓦韋提取液對(duì)抑菌作用的影響。[結(jié)果]烏蘇里瓦韋乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞球菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌均有抑制作用，但對(duì)枯草桿菌的抑制作用最強(qiáng)。最佳抑菌作用的條件為蔗糖濃度20%、Na+濃度為30%、烏蘇里瓦韋乙醇提取液的石油醚萃取物，測(cè)定對(duì)枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑為8.932 mm。[結(jié)論]烏蘇里瓦韋提取液具有抑菌作用。

烏蘇里瓦韋；抑菌作用；正交試驗(yàn)

烏蘇里瓦韋[Lepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching]為蕨類水龍骨科瓦韋屬植物，別名石茶、樹茶、還陽草、大石韋等。據(jù)記載，該植物具有清熱解毒、利尿、止咳、止血、消腫等功效[1]。在我國(guó)分布于安徽、河南、山東、河北、遼寧、吉林、黑龍江[2]。民間多用于茶飲，具有良好的消腫、抗炎的功效。其化學(xué)成分綠原酸是一類重要活性物質(zhì)，該試驗(yàn)研究烏蘇里瓦韋綠原酸提取液的體外抗菌作用，采用超聲提取法[3]，研究烏蘇里瓦韋的乙醇提取液對(duì)5種細(xì)菌的抑制效果，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究最佳抑菌效果[4-9]，為其烏蘇里瓦韋的抑菌作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。烏蘇里瓦韋，采自佳木斯市湯原縣亮子河發(fā)電廠附近；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉(3 000～9 000)；生化試劑，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要設(shè)備及儀器 。KQ-250DE型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、SHB型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)、FA2004分析天平儀(上海恒平科學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)菌種。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞球菌、枯草桿菌、沙門氏桿菌，均由佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配置。分別取烏蘇里瓦韋粉末2.0 g，采用超聲萃取法，用70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶68，超聲40 min，超聲3次，合并濾液。將提取液濃縮定容至10 ml容量瓶中，備用。精密吸取40、50、100、200、250、400、500、1000 μl烏蘇里瓦韋提取液，定容至10 ml容量瓶中。

1.2.2 篩選菌種試驗(yàn)。采用烏蘇里瓦韋提取液，分別稀釋至50、25、12.5、6.28、3.13、2.01 mg/ml溶液，制作不同濃度的直徑為6 mm的藥敏紙片，取不同的菌種1 ml，均勻地涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，當(dāng)培養(yǎng)基表面干燥后，將紙片貼于培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基倒置在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，觀察并測(cè)定抑菌環(huán)直徑，重復(fù)3次。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。

1.2.3.1 不同萃取物的抑菌試驗(yàn)。分別用石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇有機(jī)溶劑萃取烏蘇里瓦韋醇提取液，揮干有機(jī)溶劑后用蒸餾水定容至10 ml，按“1.2.2”方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選烏蘇里瓦韋抑菌成分的分布。

1.2.3.2 不同濃度的Na+溶液對(duì)抑菌試驗(yàn)的影響。取烏蘇里瓦韋醇提物1 ml，采用5%、10%、15%、20%、30% NaCl溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按“1.2.2”方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.3.3 不同濃度的蔗糖的抑菌試驗(yàn)。取烏蘇里瓦韋醇提物1 ml，用5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%蔗糖溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按照“1.2.2”方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.3.4 不同的金屬離子的抑菌試驗(yàn)。取烏蘇里瓦韋醇提液1 ml，用Cu2+、Mg2+、Al3+、Zn2+離子溶液將提取物定容至10 ml，制作6 mm的藥敏紙片，按照“1.2.2”方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.4 烏蘇里瓦韋抑菌作用正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蔗糖濃度(A)、Na+濃度(B)、不同萃取物(C)為試驗(yàn)因素，以抑菌環(huán)直徑為指標(biāo)，選用L9(33)正交表設(shè)計(jì)3水平3因素正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌種試驗(yàn)

從圖1可以看出，烏蘇里瓦韋乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、糞球菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌這5種細(xì)菌均有抑制作用。烏蘇里瓦韋對(duì)枯草桿菌的抑制作用最佳濃度為2.010 mg/ml，對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用較差，而在藥液濃度為25.068 mg/ml時(shí)，對(duì)糞球菌的抑菌效果最佳。在高濃度條件下，烏蘇里瓦韋提取液對(duì)糞球菌的抑制作用優(yōu)于其對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用，而濃度較低時(shí)對(duì)枯草桿菌的抑制作用優(yōu)于其對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用，但綜合資源利用以及最低抑菌濃度，枯草桿菌可作為抑菌試驗(yàn)最終的菌種。

2.2 單因素試驗(yàn)對(duì)抑菌作用的影響2.2.1

不同萃取物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果。有機(jī)溶劑正丁醇萃取物的抑菌效果最好，抑菌環(huán)直徑為9.63 mm，石油醚萃取物次之，抑菌環(huán)直徑為8.977 mm，二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯最弱，抑菌環(huán)直徑分別為6.310、6.987、6.431 mm，說明抑菌成分易溶于正丁醇。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑極性不同，所以不同有機(jī)溶劑提取的有效成分可能存在差異，發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑正丁醇萃取物的抑菌效果最好。

2.2.2 不同濃度的Na+溶液對(duì)抑菌試驗(yàn)的影響。當(dāng)Na+溶液濃度為15%時(shí)抑菌效果最好，烏蘇里瓦韋提取液的抑菌環(huán)直徑為10.083 mm，Na+溶液濃度為5%抑菌效果次之，抑菌環(huán)直徑為9.540 mm，Na+溶液濃度為30%時(shí)抑菌環(huán)直徑最小，為7.902 mm，說明不同濃度的Na+溶液對(duì)抑菌效果有一定影響。

2.2.3 不同濃度的蔗糖的抑菌試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)蔗糖濃度為5%時(shí)，烏蘇里瓦韋提取液的抑菌效果最好，抑菌環(huán)直徑為8.651 mm，隨著蔗糖濃度逐漸增大，抑菌環(huán)直徑降低為7.290 mm，說明蔗糖濃度繼續(xù)增大，抑菌環(huán)直徑?jīng)]有明顯增加，抑菌效果沒有明顯變化。

2.2.4 不同的金屬離子的抑菌試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)加入Cu2+、Mg2+抑菌效果較好，加入Cu2+后抑菌環(huán)直徑為7.432 mm，加入Mg2+后抑菌環(huán)直徑為7.674 mm，添加Al3+、Zn2+后抑菌環(huán)直徑最小，分別為6.881、6.853 mm。

2.3 烏蘇里瓦韋抑菌作用正交試驗(yàn)

由表1可知，單因素中不同萃取物對(duì)抑菌效果影響最大，其次是Na+濃度、蔗糖濃度。最優(yōu)組合為A2B3C1，即采用石油醚進(jìn)行萃取，Na+濃度為30%，蔗糖濃度為20%。

表1 烏蘇里瓦韋抑菌試驗(yàn)的正交設(shè)計(jì)

根據(jù)烏蘇里瓦韋抑菌試驗(yàn)正交表得出的最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行添加各種因素，最終得抑制枯草桿菌的抑菌環(huán)直徑為8.932 mm，抑菌效果高于試驗(yàn)中任何一個(gè)組合，表明蔗糖濃度為 20%、Na+濃度為 30%、烏蘇里瓦韋采用石油醚萃取液具有最佳抑菌作用。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明烏蘇里瓦韋的乙醇提取物具有抑菌作用，各因素中不同有機(jī)溶劑萃取烏蘇里瓦韋的乙醇提取液對(duì)抑菌效果影響最大，其次是Na+濃度、蔗糖濃度。在此試驗(yàn)中，烏蘇里瓦韋萃取物濃度與蔗糖濃度對(duì)抑菌效果相比，抑菌環(huán)直徑最大可達(dá)9 mm以上，抑菌效果較明顯，說明烏蘇里瓦韋具有較強(qiáng)的抑菌作用，有待于進(jìn)一步開發(fā)利用。

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第二冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:238.

[2] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第6(2)卷[M].北京：科學(xué)出版社,2000.

[3] 王麗紅,譚鳳田,趙宏.等.Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化烏蘇里瓦韋中綠原酸提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014,20(17):24.

[4] 華波.重慶特有植物荷葉鐵線藏Adiantumreniformevar.sinense多糖和黃酮的提取、抗氧化及抑菌特性研究[D].重慶：西南大學(xué),2011.

[5] 鐘愛清.三種蕨類醇提液抑菌性的初步研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2011(9):66-68.

[6] 梁曉華,梁曉東,郎曉麗,等.6種藥用蕨類植物提取液的抑菌試驗(yàn)[J].中藥材,2011,34(7):1107-1110.

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Antibacterial Action ofLepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching

WANG Li-hong1,JIANG Xiao-ting1,LIU Chang2et al

(1.College of pharmacy,Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154007;2.Third Hospital of Heilongjiang Province,Heihe,Heilongjiang 164000)

[Objective] The research aimed to approach antibacterial effect ofLepisorusussuriensis.[Method]WithLepisorusussuriensisas the research object,based on a single factor,using Na+concentration, sucrose concentration and different organic solvent extracts,the effect of the extract liquid ofLepisorusussuriensison bacteriostatic action was studied by the principle of orthogonal test.[Result]Ethanol extract liquid ofLepisorusussuriensishad a good inhibitory effect on staphylococcus aureus,escherichia coli,fecal bacteria,bacillus subtilis and salmonella,especially to the bacillus subtilis. When the sucrose concentration was 20%, and Na+concentration was 30%,Lepisorusussuriensisbacteriostatic had the best effect on petroleum ether extract, eventually, it turns out that the diameter of the bacteriostatic ring was 8.932 mm.[Conclusion]Lepisorusussuriensisextract liquid had bacteriostatic action.

Lepisorusussuriensis(Regel et Maack) Ching; Antibacterial action; Orthogonal test

佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(2014xj010);佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(LM2014_065);佳木斯大學(xué)博士基金項(xiàng)目(22zb201513)。

王麗紅(1968- )，女，遼寧海城人，教授，博士，從事植物藥的開發(fā)及利用研究。

2015-11-13

S 567

A

0517-6611(2015)35-215-02