徐曉蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱國(guó)良， 郝繼偉

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276000)

?

蒙山牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

徐曉蝶， 牟敏捷， 朱婷婷， 邱國(guó)良， 郝繼偉*

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276000)

[目的] 優(yōu)化蒙山牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。[方法] 以菌絲干重為指標(biāo)，首先采用單因素試驗(yàn)篩選適于菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳氮源，再以正交試驗(yàn)優(yōu)化碳源與氮源以及無(wú)機(jī)鹽與VB1的最佳配比。[結(jié)果] 蒙山野生牛肝菌優(yōu)化的液體培養(yǎng)基配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。[結(jié)論] 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化的蒙山牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及后繼研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

正交設(shè)計(jì)；牛肝菌；液體培養(yǎng)基

牛肝菌(Boletussp) 是一種菌根真菌，通常與松樹(shù)的樹(shù)根形成共生菌根，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目牛肝菌科[1]。全世界范圍內(nèi)已確定的牛肝菌屬共有130多種，在我國(guó)可食用的有31種[2]。蒙山牛肝菌是生長(zhǎng)在沂蒙山區(qū)山林中的一類野生牛肝菌，具有獨(dú)特的風(fēng)味和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受當(dāng)?shù)厝藗兊南矏?ài)，作為一種藥用真菌具有很大的商業(yè)開(kāi)發(fā)潛力。

牛肝菌作為一種菌根真菌，目前尚不能人工栽培，但其液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲的營(yíng)養(yǎng)成分和其子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成分基本一致，通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)牛肝菌將是未來(lái)研究的趨勢(shì)[3]。筆者利用正交設(shè)計(jì)法，對(duì)野生蒙山牛肝菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分進(jìn)行優(yōu)化，以期為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及后繼研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種。蒙山野生牛肝菌鮮菇采自蒙山。

1.1.2 儀器設(shè)備。SW-CJ超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，DGG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，EO2140型分析天平，DKY2型恒溫培養(yǎng)搖床，電磁爐。

1.1.3 培養(yǎng)基。①母種培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，麩皮30 g(煮汁)，VB10.5 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂20 g，水1 000 ml。②液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨3 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB10.5 g/L。③碳源優(yōu)化培養(yǎng)基：以液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖作對(duì)照，分別用乳糖20 g/L、麥芽糖20 g/L、蔗糖20 g/L、可溶性淀粉20 g/L、甘露醇20 g/L代替葡萄糖。④氮源優(yōu)化培養(yǎng)基：以液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨作對(duì)照，分別用酵母膏10 g/L、牛肉膏10 g/L、(NH4)2SO410 g/L、豆粕10 g/L代替蛋白胨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斜面菌種制備。母種培養(yǎng)基滅菌后擺成斜面，在無(wú)菌條件下采用組織塊法將牛肝菌鮮菇接種到斜面培養(yǎng)基中部，然后置于25 ℃下培養(yǎng)15 d左右，即可得到蒙山牛肝菌的斜面菌種。挑選無(wú)污染、健壯的菌種備用。

1.2.2 液體菌種制備。液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基按配方配制好后，按每瓶150 ml倒入干凈的250 ml三角瓶中，用透氣封口膜封口并用牛皮紙包裹瓶口，于121 ℃下滅菌20 min。冷卻后，取0.5～1.0 cm2的母種塊接入液體菌種。先25 ℃下靜置培養(yǎng)2 d，然后120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，在瓶中即可看到大量菌球形成。

1.2.3 發(fā)酵試驗(yàn)。無(wú)菌條件下用滅過(guò)菌的玻棒破碎液體菌種的菌球，然后按10%(V/V)的接種量用無(wú)菌吸管吸取液體菌種，接種于滅菌后的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、120 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d。

1.2.4 菌絲重量測(cè)定。發(fā)酵試驗(yàn)后通過(guò)觀察剔除污染的試驗(yàn)處理，如果由于污染影響到試驗(yàn)結(jié)果的分析，需要補(bǔ)充相關(guān)試驗(yàn)。將無(wú)污染三角瓶中的菌體與培養(yǎng)液的混合物置于80 目網(wǎng)篩上過(guò)篩，通過(guò)蒸餾水洗滌后，置于80 ℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

從圖1可以看出，蒙山牛肝菌在乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇6種培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)。其中以乳糖、可溶性淀粉作碳源時(shí)，菌絲產(chǎn)量最高，所以選用乳糖、可溶性淀粉作為正交試驗(yàn)的碳源因子。

2.2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

從圖2可以看出，蒙山牛肝菌對(duì)酵母膏、牛肉膏的利用效果較好，且二者的菌絲產(chǎn)量接近，但對(duì)銨鹽的利用效果較差，所以采用酵母膏、牛肉膏作為正交試驗(yàn)的氮源因子。

2.3 碳氮源組合的優(yōu)化

碳氮源組合優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基為KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、VB10.5 g/L。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加不同濃度的乳糖和可溶性淀粉作為碳源，添加不同濃度的酵母膏和牛肉膏作為氮源，采用L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)確定碳氮源的最佳組合。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，并設(shè)3次重復(fù)。通過(guò)測(cè)定菌絲干重來(lái)確定碳氮源的最佳組合。

表1 碳氮源正交試驗(yàn)的因素與水平 g/L

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，乳糖(A)與酵母膏(C)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果并無(wú)顯著影響(P>0.05)；而可溶性淀粉(B)與牛肉膏(D)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響(P<0.01)，進(jìn)一步結(jié)合表2極差分析結(jié)果R(B)>R(D)>R(A)>R(C)，可知4因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大小依次為可溶性淀粉、牛肉膏、乳糖、酵母膏。

由表2可知，處理A2B2C3D3菌絲干重最大，A3B2C1D2與A2B2C3D3無(wú)顯著差異，則二者均為最好水平組合。但從極差分析結(jié)果可知，A2B2C2D2應(yīng)為最佳水平組合，該組合在正交試驗(yàn)表中并未出現(xiàn)，需要作驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲干重平均值為22.4 g/L，高于其他兩組合，但并無(wú)顯著差異。因此，A2B2C2D2雖為該試驗(yàn)最佳水平組合，但由于乳糖與酵母膏對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，因此建議生產(chǎn)中因降低生產(chǎn)成本的需要可采用的最佳碳氮源組合為A1B2C1D2，即乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L。

表2 碳氮源正交試驗(yàn)結(jié)果

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 無(wú)機(jī)鹽及維生素的優(yōu)化

以碳氮源最佳組合即乳糖10 g/L、可溶性淀粉20 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏10 g/L為供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基內(nèi)分別添加不同濃度的KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定無(wú)機(jī)鹽與維生素的最佳配比，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表3，并設(shè)3次重復(fù)。通過(guò)測(cè)定菌絲干重來(lái)確定無(wú)機(jī)鹽與維生素的最佳配比。

表3 無(wú)機(jī)鹽及維生素正交試驗(yàn)因素與水平 g/L

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，KH2PO4(A)與MgSO4·7H2O(B)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響(P<0.05)；而VB1(C)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響(P>0.05)，進(jìn)一步結(jié)合表4極差分析結(jié)果R(A)>R(B)>R(C)，可知3因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大小依次為KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1。

由表4可知，處理A2B2C3菌絲干重最大，與A2B1C1、A1B2C2和A2B3C2間無(wú)顯著差異，但從極差分析結(jié)果可知，A2B2C2應(yīng)為最佳水平組合，該組合在正交試驗(yàn)表中并未出現(xiàn)，需要作驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲干重平均值為22.8 g/L，與A2B2C3相近?？紤]到VB1(C)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，因此建議生產(chǎn)中采用的無(wú)機(jī)鹽及維生素組合為A2B2C1，即KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。

表4 無(wú)機(jī)鹽及維生素正交試驗(yàn)結(jié)果

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

該研究表明，蒙山野生牛肝菌液體培養(yǎng)基最佳配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L,與張揚(yáng)等[4]對(duì)紅絨蓋牛肝菌的研究、郭永月等[5]對(duì)黑牛肝菌的研究、冮潔等[6]對(duì)美味牛肝菌的研究略有差別，主要原因?yàn)榕８尉贩N不同。但以上研究中有一共同點(diǎn)，即其配方中的碳氮源均為有機(jī)的，由此可見(jiàn)牛肝菌在液體培養(yǎng)中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求較全面。

在通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化培養(yǎng)基的過(guò)程中，多數(shù)人單純根據(jù)極差法得到最佳組合[4]，往往得出的結(jié)論較片面化、理論化。而極差法與方差分析法相結(jié)合得到的結(jié)論更加合理、應(yīng)用性更強(qiáng)。該試驗(yàn)中得出的最佳配方為乳糖10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，相較于單純根據(jù)極差法得到的結(jié)論可以減少非顯著因素的用量，在生產(chǎn)上可節(jié)約生產(chǎn)成本，提高一定的經(jīng)濟(jì)效益。

[1] 茆曉嵐.中國(guó)經(jīng)濟(jì)真菌[M].北京:科學(xué)出版社,1998:328.

[2] 李泰輝，宋斌．中國(guó)食用牛肝菌的種類及其分布[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2002，9(2)：22-30.

[3] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等.真菌分類學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984：247-278.

[4] 張揚(yáng)，趙陽(yáng)，范克勝，等．紅絨蓋牛肝菌發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及液體培養(yǎng)條件[J]．林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2013，27(4)：111-114.

[5] 郭永月，陶明煊，周斌，等．黑牛肝菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．食品工業(yè)科技，2012，33(9)：183-186.

[6] 冮潔，張茜.美味牛肝菌液體培養(yǎng)及其在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]．食品工業(yè)科技，2009，30(7)：223-226.

The Optimization of Liquid Fermentation Medium of Mengshan Mountain Boletus

XU Xiao-die, MU Min-jie, ZHU Ting-ting, HAO Ji-wei*et al

(College of Life Science, Linyin Normal University, Linyi, Shandong 276000)

[Objective] The aim was to optimize liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus. [Method] Adopting mycelial dry of Mengshan mountain boletus as major index, firstly the single factor method was used to select the best carbon source and nitrogen source for mycelium growth, and then the optimum ratio of carbon source, nitrogen source, inorganic salt and VB1was optimized by the orthogonal experiment. [Result] The optional liquid fermentation medium of Mengshan mountain boletus were as follow: lactose of 10 g/L，soluble starch of 20 g/L, yeast extract of 5 g/L, beef paste of 10 g/L, KH2PO4of 1 g/L，MgSO4·7H2O of 1 g/L. [Conclusion] The optimized liquid fermentation culture medium of Mengshan mountain boletus by the orthogonal design has a certain application value, and can provide the basic data for large-scale fermentation and subsequent research.

Orthogonal design; Boletus;Liquid fermentation medium

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目。

徐曉蝶(1997- )，女，安徽亳州人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，副教授，從事食藥真菌開(kāi)發(fā)利用及野生資源保護(hù)方面的研究。

2015-10-20

S 336

A

0517-6611(2015)35-241-02