徐勝男，時(shí)建立，彭 喆，徐紹建，吳曉燕，叢曉燕，杜以軍，吳家強(qiáng)，李 ?。?，王金寶＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是1974年由德國(guó)學(xué)者Tischer等首次從豬腎傳代細(xì)胞（PK15）中分離得到，1982年被命名為豬圓環(huán)病毒［1］。豬圓環(huán)病毒分為兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。其中，只有PCV2具有致病性，能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），皮炎和腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS），增生性壞死性間質(zhì)性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）等疾?。?］，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病毒已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但其致病機(jī)制目前尚未完全清楚。

豬圓環(huán)病毒2型主要由與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，與免疫原性相關(guān)的Cap蛋白及ORF3編碼的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白3種蛋白組成［3］，其中Rep蛋白含有3個(gè)N－糖基化位點(diǎn)，即23～25aa（NPS）、256～258aa（NQT）和286～288aa（NAI）［4］。糖基化作為一種主要的翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能有著重要影響，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起著重要的作用。目前有PCV2Cap蛋白N－糖基化位點(diǎn)突變對(duì)PCV2核酸疫苗免疫原性影響的報(bào)道［5］，但Rep蛋白N－糖基化位點(diǎn)突變?cè)诓《緩?fù)制及致病性中的作用如何未見報(bào)道。

Fenaux等［6］報(bào)道，雙拷貝PCV2DNA克隆的感染性明顯強(qiáng)于單拷貝PCV2DNA克隆，拯救病毒的增殖滴度接近其親本病毒。因此，本研究擬在前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的單拷貝PCV2感染性克?。?］的基礎(chǔ)上，獲得三個(gè)單點(diǎn)突變的雙拷貝PCV2全長(zhǎng)感染性克隆。在體外拯救突變病毒的基礎(chǔ)上，進(jìn)行接種PK－15細(xì)胞，研究突變病毒的復(fù)制性，以明確Rep蛋白N－糖基化位點(diǎn)突變對(duì)病毒復(fù)制的影響，為進(jìn)一步闡明PCV2的復(fù)制及致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

無豬圓環(huán)污染的PK－15細(xì)胞、重組質(zhì)粒PEASY－Blunt－PCV2、單拷貝突變體感染性克隆M 23、M 256、M 286由山東省畜禽疫病防治及繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑

PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TransStartTM FastPfu DNA聚合酶、Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY－Blunt Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T4DNA連接酶、dNTP、DNA Marker DL－2 000和DL－5 000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、SacII、XhoI購(gòu)自NEB有限公司；LipofectamineTM 3 000、胰酶、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；PCV2／Cap單克隆抗體由山東省畜禽疫病防治及繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；D－氨基葡萄糖、FITC標(biāo)記的羊抗鼠的二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司。

1.3 主要儀器

PTC－2000型PCR儀購(gòu)自美國(guó)MJResearch公司；核酸定量?jī)x購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Light－Cycle480購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PCV2基因序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)、合成1對(duì)含有SacII、XhoI酶切位點(diǎn)及1對(duì)含有SacII、BamHI酶切位點(diǎn)的能擴(kuò)增PCV2全長(zhǎng)的PCR引物P1、P2、P3、P4。

1.5 雙拷貝突變體2M23、2M256、2M286及未突變體2PCV2的構(gòu)建

1.5.1 A片段的構(gòu)建 分別以重組質(zhì)粒PEASYBlunt－PCV2及單拷貝突變體感染性克隆M 23、M 256、M 286為模板，P1、P2為引物擴(kuò)增其全長(zhǎng)。使用50μL體系：引物（10μM各2μLdNTPs10 mM）2μL；TransStartTM FastPfu DNA聚合酶1 μL；5×TranStart FastPfu Buffer 10μL；模板20倍稀釋后取2μL；滅菌水補(bǔ)齊50μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃10min，變性95℃1min，退火59℃1min，延伸72℃2min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。跑膠回收1 767bp的片段并用XhoI、SacII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切、膠回收后命名為A片段。

1.5.2 B片段的構(gòu)建 分別以重組質(zhì)粒PEASYBlunt－PCV2及單拷貝突變體感染性克隆M 23、M 256、M 286為模板，用引物P3、P4擴(kuò)增其全長(zhǎng)，其他同1.5.1。膠回收1 767bp的片段并用BamHI、SacII限制性內(nèi)切酶雙酶切、膠回收后命名為B片段。

1.5.3 C載體的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒PEASY－Blunt－PCV2進(jìn)行XhoI、SacII限制性內(nèi)切酶雙酶切，跑膠回收大小約為3 900bp的片段并命名為C載體。

1.5.4 D載體的構(gòu)建 將A片段用T4DNA連接酶連入C載體。雙酶切驗(yàn)證正確后命名為D載體。1.5.5 雙拷貝感染性克隆的構(gòu)建 用BamHI、SacII限制性內(nèi)切酶雙酶切D載體，跑膠回收大小約為5 700bp的片段，將B片段連入該載體，轉(zhuǎn)化Trans－T1感受態(tài)細(xì)胞中，并進(jìn)行雙酶切、測(cè)序鑒定。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及間接免疫熒光檢測(cè)

將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的無PCV污染的PK－15細(xì)胞用胰酶進(jìn)行常規(guī)消化鋪6孔板，每空2mL，密度為0.25×106～1×106，37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿70%～90%時(shí)按照LipofectamineTM3 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將2M23、2M256、2M286和2PCV2DNA克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無PCV污染的PK－15細(xì)胞，并設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染為對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后48h參照文獻(xiàn)［8］中的方法，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行洗滌、固定等處理后，用PCV2／Cap單克隆抗體作為一抗，用FITC－羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）來檢測(cè)病毒抗原；同時(shí)將部分拯救病毒接種新培養(yǎng)的PK－15細(xì)胞并連續(xù)傳至5代。

1.7 拯救病毒TCID50的測(cè)定

取拯救病毒2M23、2M256、2M286和2PCV2每一代的細(xì)胞培養(yǎng)物分別以10－1～10－8的稀釋度接種到96孔細(xì)胞板，培養(yǎng)72h后進(jìn)行IFA檢測(cè)，按照Reed－Muench法計(jì)算其TCID50。測(cè)定拯救病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律。

1.8 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞的病毒載量

將盲傳至第5代的細(xì)胞毒2M23、2M256、2M 286和2PCV2DNA反復(fù)凍融后分別提取DNA，用實(shí)驗(yàn)室之前建好的以0RF2為靶基因的SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行定量檢測(cè)［9］，研究細(xì)胞中病毒核酸的變化規(guī)律。反應(yīng)體系為25 μL：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL、引物各1μL、模板2μL、去離子水8.5μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃20s，55℃20s，70℃30s且收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。

圖1 D載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restriction enzyme digestion identification of D vector by enzyme digestion

2 結(jié)果與分析

2.1 雙拷貝2M23、2M256、2M286和2PCV2感染性克隆的鑒定

將D載體用XhoI、SacII進(jìn)行雙酶切產(chǎn)生2個(gè)條帶，大小分別與PEASY－Blunt載體片段（3 929 bp）和A片段（1 767bp）相符（圖1）。2M23、2M 256、2M286和2PCV2經(jīng)BamHI、SacII雙酶切后得到2個(gè)條帶，大小分別與D載體（5 700bp）和B片段（1 767bp）相符（圖2）。

圖2 雙拷貝感染性克隆酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of double copies Infectious clone by enzyme digestion

2.2 測(cè)序鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒2M23、2M256、2M286和2PCV2及盲傳5代后的拯救病毒DNA進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，雙拷貝全基因組按照預(yù)先設(shè)計(jì)的成功順式串聯(lián)入載體；盲傳5代后的病毒DNA除之前設(shè)計(jì)的ORF1 23aa、256aa、286aa位點(diǎn)由天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―）之外，其他均與PCV2SD1全基因組（DQ346683）序列完全相同，沒有出現(xiàn)其他任何變異。

2.3 IFA檢測(cè)結(jié)果

將盲傳5代的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒2M23、2M256、2M 286和2PCV2及空載體在72h以后進(jìn)行IFA檢測(cè)。如圖3所示，所有拯救病毒都能檢測(cè)到特異性熒光信號(hào)，其中2M286和2PCV2（圖3C、D）的熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量明顯高于2M23和2M256（圖3A、B），而轉(zhuǎn)染空載體的PK－15細(xì)胞則沒有特異性熒光染色。檢測(cè)結(jié)果表明，PCV2Rep蛋白N－糖基化位點(diǎn)突變后病毒均能在PK－15細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但N－糖基化位點(diǎn)23～25aa、256～258aa突變后表達(dá)量明顯低于未突變體病毒；N－糖基化位點(diǎn)286～288aa突變后對(duì)表達(dá)量影響較小。

圖3 拯救病毒IFA的檢測(cè)結(jié)果（200×）Fig.3 Rescued viruses detected by IFA（200×）

2.4 病毒TCID50的測(cè)定結(jié)果

對(duì)上述拯救的病毒以1∶5的比例感染PK－15細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，表明1～2代的拯救病毒增殖比較緩慢，自第3代起病毒增殖加快，傳至第5代病毒

圖4 拯救病毒不同代次病毒體外增殖曲線Fig.4 Growth curve of the rescued viruses during different passages

2.5 細(xì)胞病毒載量檢測(cè)結(jié)果

用SYBR－Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)突變病毒和親本病毒進(jìn)行細(xì)胞中病毒載量的定量檢測(cè)，各突變體病毒與親本病毒相比差異顯著（P＜0.05）。PCV2Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N－糖基化位點(diǎn)突變后降低病毒的復(fù)制能力冊(cè)，而286～288aa N－糖基化位點(diǎn)突變后能增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力（圖5）。

3 討 論

PCV2是引起豬圓環(huán)病毒疾病的主要致病因子，是危害目前世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原［10］。由于基因型的改變和基因組大小的變化均發(fā)生在ORF2內(nèi)［11］，因此人們的研究熱點(diǎn)均集中在PCV2Cap蛋白，而ORF1的研究相對(duì)較少。ORF1作為PCV2最大的開放閱讀框編碼的Rep蛋白對(duì)病毒的復(fù)制至關(guān)重要，PCV1與PCV2相比較，Rep蛋白氨基酸序列同源性達(dá)86%，這也是2種血清型PCV病毒產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在［12］，所以對(duì)PCV2Rep蛋白的研究也至關(guān)重要。

N－糖基化在病毒的發(fā)病機(jī)理和免疫逃避中扮演著重要的角色［13］，在病毒顆粒的包裝和成熟、感染力及擴(kuò)散等方面也有著重要的作用［14］。因此，這一領(lǐng)域的研究已成為近年來的研究熱點(diǎn)。將PCV2的Cap蛋白N－糖基化位點(diǎn)突變后的PCV2核酸疫苗免疫小鼠能增強(qiáng)DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的特異性反應(yīng)［5］。為研究Rep蛋白上N－糖基化位點(diǎn)突變后對(duì)病毒生理特性的影響，本試驗(yàn)構(gòu)建了雙拷貝單點(diǎn)突變PCV2全長(zhǎng)感染性克隆。在體外拯救病毒的基礎(chǔ)上，研究N－糖基化位點(diǎn)突變對(duì)病毒復(fù)制的影響。

圖5 細(xì)胞中病毒的定量檢測(cè)Fig.5 Quantitative detection of virus in cells

本研究結(jié)果表明，PCV2Rep蛋白的23～25毒價(jià)基本穩(wěn)定。2M232M256突變體病毒毒價(jià)明顯低于未突變體病毒2PCV2；2M286突變體病毒毒價(jià)要稍高于未突變病毒2PCV2的毒價(jià)（圖4）。aa、256～258aaN－糖基化位點(diǎn)突變后病毒的復(fù)制能力明顯降低，286～288aaN－糖基化位點(diǎn)突變后反而增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力。對(duì)于N－糖基化兩點(diǎn)和三點(diǎn)之間的相互作用，以及對(duì)病毒致病力的影響如何需要進(jìn)一步研究。

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