劉　華，陳　昊，唐　照，張葉敏，李明欣，汪長(zhǎng)華△(連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇連云港00;武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢43007)

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骨橋蛋白通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗*

劉華1，陳昊1，唐照2，張葉敏2，李明欣2，汪長(zhǎng)華2△
(1連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇連云港222002;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

［摘要］目的:探討骨橋蛋白(osteopontin，OPN)對(duì)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響及其可能的機(jī)制。方法:低血清培養(yǎng)輔以胰島素處理誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞分化為C2C12肌細(xì)胞，蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，離心法分離細(xì)胞膜，葡萄糖攝取試劑盒定量葡萄糖攝取。結(jié)果: (1)骨橋蛋白以劑量依賴和時(shí)間依賴方式抑制胰島素刺激的蛋白激酶B(Akt)的磷酸化，并抑制胰島素所致的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (Glut4)膜位移和葡萄糖的攝取;而特異性的抗OPN受體CD44抗體預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)上述變化。(2) OPN可誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并促進(jìn)c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)可降低OPN所增加的JNK磷酸化，恢復(fù)胰島素刺激所致的Glut4的膜位移以及葡萄糖攝取。結(jié)論:骨橋蛋白通過(guò)誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致胰島素抵抗。本研究為揭示骨橋蛋白在胰島素抵抗和糖尿病中的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論解釋。

［關(guān)鍵詞］骨橋蛋白;胰島素抵抗;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激; C2C12肌細(xì)胞

［修回日期］2015-01-26

Osteopontin-induced ER stress results in insulin resistance in C2C12 myocytes

LIU Hua1，CHEN Hao1，TANG Zhao2，ZHANG Ye-min2，LI Ming-xin2，WANG Changhua2
(1Department of Pathology，The First People’s Hospital of Lianyungang，Lianyungang 222002，China;2Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the potential role of osteopontin (OPN) in insulin resistance in C2C12 myocytes and its underlying mechanism.METHODS: C2C12 myoblasts were induced by low concentration of serum and insulin treatment to differentiate into myocytes.Western blot was performed to detect the protein abundance and phosphorylation using specific antibodies.Plasma membrane was isolated by centrifugation.Glucose uptake was measured by glucose uptake assay.RESULTS: OPN treatment suppressed insulin-stimulated protein kinase B (Akt) phosphorylation in a dose-and time-dependent manner，accompanied with decreased membrane translocation of glucose transporter type 4 (Glut4) and reduced glucose uptake.Neutralization of OPN specific receptor in skeletal muscle with CD44 antibody mitigated OPN-induced inhibitory impact on insulin action.Furthermore，OPN treatment resulted in endoplasmic reticulum (ER) stress and phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase (JNK).Administration of ER stress inhibitor 4-phenylbutyrate (4-PBA) diminished the detrimental effects of OPN on JNK phosphorylation，Glut4 membrane translocation and glucose uptake.CONCLUSION: ER stress mediated OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes.

［KEY WORDS］Osteopontin; Insulin resistance; Endoplasmic reticulum stress; C2C12 myocytes

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達(dá)在多種細(xì)胞和組織中，如纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，具有多種生物學(xué)功能，在炎癥、肥胖、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1］。OPN血漿含量的增高見(jiàn)于肥胖和糖尿病，增加的血漿OPN含量將導(dǎo)致器官的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗等［2-3］。敲除OPN或者利用抗OPN抗體中和OPN，可防止高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞脂肪變、肝葡萄糖異生、系統(tǒng)胰島素抵抗等發(fā)生，并最終降低血糖水平［4-6］。

骨骼肌是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)葡萄糖消耗的主要器官之一，其葡萄糖代謝狀態(tài)在糖尿病的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。骨骼肌的胰島素敏感性降低將直接導(dǎo)致其葡萄糖代謝失調(diào)，引發(fā)血糖增加［7］。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞可產(chǎn)生OPN［1］，并接受OPN的調(diào)節(jié)［8］，OPN可影響骨骼肌細(xì)胞的再生、纖維化以及細(xì)胞大小等［8］。但迄今為止，OPN對(duì)骨骼肌胰島素抵抗影響的報(bào)道并不多見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn): OPN以劑量和時(shí)間依賴方式直接誘導(dǎo)培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗，其機(jī)制與OPN誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關(guān)。

材料和方法

1材料與試劑

鼠源OPN蛋白、結(jié)晶牛胰島素和抗tubulin抗體購(gòu)于Sigma;抗蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)抗體、抗磷酸化Akt(p-Akt)抗體、抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (glucose transporter type 4，Glut4)抗體、抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體、抗C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體、抗磷酸化肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)抗體、抗胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)抗體和抗磷酸化IRS-1抗體購(gòu)于CST;抗堿性磷酸酶標(biāo)記的II抗購(gòu)自Santa Cruz;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)購(gòu)自Calbiochem;葡萄糖攝取測(cè)定試劑盒、抗鈣黏蛋白(cadherin，Cad)抗體、抗CD44抗體、抗c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和磷酸化JNK抗體購(gòu)于Abcam。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分化C2C12成肌細(xì)胞購(gòu)于ATCC，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中。C2C12肌細(xì)胞分化按文獻(xiàn)方法進(jìn)行［9-10］，基本步驟如下: 100%匯合的C2C12成肌細(xì)胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)3 d;采用含1% P/S、0.1% FBS和50 nmol/L胰島素的DMEM誘導(dǎo)分化4 d，然后更換常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。1周后，80%～100%的細(xì)胞將形成肌管，并用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2葡萄糖攝取的測(cè)定采用葡萄糖攝取測(cè)定試劑盒測(cè)定，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)蛋白的提取與定量按本實(shí)驗(yàn)室以前報(bào)告的方法進(jìn)行［10］。蛋白定量后的細(xì)胞裂解液與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸變性蛋白，14 000×g離心1 min，取上清行SDSPAGE。蛋白免疫印跡的基本流程如下:恒壓100 V電泳，恒壓100 V、140 min、4℃電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，1%牛血清白蛋白封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)顯色，Image-Pro Plus軟件分析結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。組間比較計(jì)量數(shù)據(jù)資料按student t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)按x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上。

結(jié)果

1骨橋蛋白以劑量依賴和時(shí)間依賴形式誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗

為觀察OPN對(duì)骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的劑量影響，C2C12肌細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清處理4 h，然后接受0.1、1、10 mg/L的OPN處理12 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。1 mg/L和10 mg/L濃度的OPN可有效抑制胰島素刺激的Akt在Thr308位點(diǎn)的磷酸化，表明該濃度的OPN可導(dǎo)致胰島素抵抗。為觀察OPN誘導(dǎo)胰島素抵抗的時(shí)間效應(yīng)，無(wú)血清處理的C2C12肌細(xì)胞分別接受1 mg/L OPN處理6 h、12 h、18 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。結(jié)果表明:處理12 h以上可顯著降低胰島素刺激的Akt在Thr308位點(diǎn)的磷酸化。為觀察OPN對(duì)葡萄糖攝取的影響，C2C12肌細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清處理4 h，然后接受1 mg/L OPN處理12 h，10 nmol/L胰島素處理10 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn): OPN可降低Glut4向質(zhì)膜的位移，并抑制胰島素對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果表明OPN處理可降低C2C12肌細(xì)胞對(duì)胰島素作用的敏感性，見(jiàn)圖1。

2 CD44抗體可逆轉(zhuǎn)OPN對(duì)胰島素敏感性的影響

OPN通過(guò)與跨膜蛋白，如integrin和CD44結(jié)合發(fā)揮作用［11］，而C2C12細(xì)胞主要表達(dá)CD44［12］。為進(jìn)一步確定OPN誘導(dǎo)胰島素抵抗的作用，經(jīng)無(wú)血清處理4 h的C2C12肌細(xì)胞，接受10 mg/L抗CD44抗體預(yù)處理1 h［13］，然后接受1 mg/L OPN處理12 h，最后用10 nmol/L胰島素處理10 min。CD44抗體處理可以恢復(fù)胰島素刺激的Akt磷酸化;同時(shí)，經(jīng)CD44處理的C2C12肌細(xì)胞可對(duì)抗OPN對(duì)Glut4的質(zhì)膜位移和葡萄糖攝取的不利影響。結(jié)果表明: OPN主要經(jīng)CD44受體蛋白發(fā)揮作用，中和其受體蛋白可抵抗OPN誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗，見(jiàn)圖2。

Figure 1.OPN induced insulin resistance in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; INS: insulin; Cad: cadherin.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs INS group.圖1骨橋蛋白誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗

3骨橋蛋白可誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在胰島素抵抗的發(fā)生中具有重要作用［14］。為研究OPN對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的可能影響，C2C12肌細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清處理4 h，然后接受1 mg/L OPN處理12 h。蛋白免疫印跡檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)。OPN處理顯著增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP以及磷酸化的IRE1α的表達(dá)。當(dāng)無(wú)血清處理的C2C12肌細(xì)胞經(jīng)10 mg/L抗CD44抗體預(yù)處理1 h后，再接受1 mg/L OPN處理12 h，并不能增加上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果提示: OPN可通過(guò)與CD44的結(jié)合誘導(dǎo)C2C12骨骼肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，見(jiàn)圖3。

4抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可減輕骨橋蛋白誘導(dǎo)的C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗

為闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在OPN誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗中的介導(dǎo)作用，C2C12肌細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清處理4 h，然后同時(shí)接受1 mg/L的OPN和3 mmol/L的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA處理12 h，以及10 nmol/L的胰島素處理10min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPN可增加JNK和IRS-1絲氨酸307位點(diǎn)的磷酸化，而4-PBA處理可顯著降低JNK和IRS-1絲氨酸307位點(diǎn)的磷酸化。此外，結(jié)果還顯示: 4-PBA處理可逆轉(zhuǎn)OPN所致的Akt在Thr308位點(diǎn)磷酸化的降低和IRS-1在絲氨酸307位點(diǎn)磷酸化的增加、Glut4膜位移減少以及葡萄糖攝取量的降低。結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了OPN誘導(dǎo)的C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗，見(jiàn)圖4。

Figure 2.OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes was prevented by neutralization with anti-CD44 antibody.OPN: osteopontin; Ab: antibody; INS: insulin.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs INS group;##P＜0.01 vs OPN plus INS group.圖2中和骨橋蛋白受體CD44可逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗

討論

OPN在胰島素抵抗和糖尿病中的作用已有文獻(xiàn)報(bào)道。OPN的高表達(dá)與胰島素抵抗、糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，敲除或中和OPN可以起到降低系統(tǒng)胰島素抵抗、降低血糖、改善糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的作用［4-6］，并認(rèn)為其機(jī)制與炎癥反應(yīng)等有關(guān)［2-3］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn):骨橋蛋白以劑量依賴和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗，而且這一作用可被中和肌細(xì)胞上OPN受體CD44的抗體逆轉(zhuǎn)。這一結(jié)果表明OPN可直接誘導(dǎo)肌細(xì)胞胰島素抵抗的發(fā)生，這為OPN誘導(dǎo)胰島素抵抗的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論解釋。

胰島素是由胰腺β細(xì)胞分泌的具有調(diào)節(jié)血糖作用的重要激素。胰島素通過(guò)與其在細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合而激活I(lǐng)RS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路，使葡萄糖轉(zhuǎn)移子4從胞漿向細(xì)胞膜上位移，葡萄糖借此從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，由此起到降低血糖的作用。在這一信號(hào)通路上的任何一個(gè)信號(hào)蛋白分子的含量降低或者功能活性下降均將導(dǎo)致胰島素不能發(fā)揮正常的生理功能，即胰島素敏感性降低或胰島素抵抗［15］。導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制有很多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為其中的重要機(jī)制之一［14-15］。

Figure 3.OPN induced ER stress in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; Ab: antibody.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs OPN group.圖3骨橋蛋白誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為蛋白質(zhì)合成、折疊、修飾的重要場(chǎng)所。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白增加時(shí)，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)張力增加(即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)，并由此引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(即未折疊蛋白反應(yīng))。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可激活JNK的磷酸化，而活化的JNK將導(dǎo)致IRS-1絲氨酸磷酸化的增加、酪氨酸磷酸化的降低，并由此抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn): OPN可誘導(dǎo)C2C12肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并促進(jìn)JNK磷酸化。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可降低OPN所增加的JNK磷酸化，降低IRS-1絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，恢復(fù)胰島素刺激所致的Akt磷酸化、Glut4的膜位移以及葡萄糖攝取。因此，有理由認(rèn)為OPN誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗通

過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)。

Figure 4.ER stress inhibitor attenuated OPN-induced insulin resistance in C2C12 myocytes.OPN: osteopontin; INS: insulin.Mean ±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs INS group;##P＜0.01 vs OPN plus INS group.圖4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑減輕骨橋蛋白誘導(dǎo)的C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗

總之，本研究結(jié)果表明OPN通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肌細(xì)胞胰島素抵抗。該研究結(jié)果加深了對(duì)OPN在肥胖、胰島素抵抗以及糖尿病中作用的認(rèn)識(shí)，為抗糖尿病治療提供了新的作用靶點(diǎn)。

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通訊作者△Tel: 027-68759846; E-mail: chwang0525@ wuh.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30770758/H0178)

［收稿日期］2014-12-25

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1075-06

［中圖分類號(hào)］R363.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.019