閆　蕊，單　虎，林　琳，刁佳宇，張　明，朱延河，譚武紅，魏　瑾△

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2地方病科，3呼吸內(nèi)科，陜西西安710004;4西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，微量元素與地方病衛(wèi)生部重點實驗室，陜西西安710061)

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鈣網(wǎng)蛋白介導(dǎo)線粒體損傷在高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中的作用*

閆蕊1，2，單虎1，2，林琳1，2，刁佳宇1，2，張明3，朱延河4，譚武紅4，魏瑾1，2△

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2地方病科，3呼吸內(nèi)科，陜西西安710004;
4西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，微量元素與地方病衛(wèi)生部重點實驗室，陜西西安710061)

［摘要］目的:觀察高糖培養(yǎng)對心肌細胞鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)表達的變化、線粒體功能和細胞凋亡的影響。方法:將培養(yǎng)的AC-16人心肌細胞隨機分為正常糖濃度組、高糖組、高糖+ CRT siRNA(small interfering RNA)組及等滲組，分別測定各組心肌細胞凋亡率、細胞內(nèi)活性氧水平、線粒體功能和CRT表達水平的變化。結(jié)果:與正常糖濃度培養(yǎng)的心肌細胞相比，高糖組心肌細胞凋亡率增加，活性氧生成增多，線粒體膜電位及呼吸鏈酶活性降低，同時CRT表達升高; CRT siRNA可以減輕高糖組心肌細胞線粒體損傷，但細胞內(nèi)活性氧的生成與高糖組相比未見顯著差異。結(jié)論: CRT介導(dǎo)的線粒體損傷可能參與高糖時心肌細胞凋亡的增加。

［關(guān)鍵詞］高糖;鈣網(wǎng)蛋白;線粒體損傷;細胞凋亡

［修回日期］2015-03-24

Role of calreticulin-induced mitochondrial damage in high glucose-induced apoptosis of myocardial cells

YAN Rui1，2，SHAN Hu1，2，LIN Lin1，2，DIAO Jia-yu1，2，ZHANG Ming3，ZHU Yan-he4，TAN Wu-hong4，WEI Jin1，2
(1Department of Cardiology，2Department of Endemic Disease，3Department of Respiratory Medicine，Second Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University School of Medicine，Xi’an 710004，China;4Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education，Key Laboratory of Trace Elements and Endemic Disease of Ministry of Health，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China.E-mail: weijin@ mail.xjtu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of high glucose on the protein expression of calreticulin (CRT) and its association with cell apoptosis and mitochondrial dysfunction in the cardiomyocytes.METHODS: AC-16 cardiomyocytes were randomly divided into normal glucose group，high glucose group，high glucose+ CRT siRNA group and isotonic control group.The cell apoptotic rate，reactive oxygen species (ROS)，mitochondrial membrane potential level，respiratory enzyme activity，and protein expression of CRT were observed.RESULTS: Compared with the cardiomyocytes in normal glucose group，the apoptotic rate and ROS production of cardiomyocytes increased in high glucose group，accompanying with the decreases in the mitochondrial membrane potential level and enzyme activitiy of the respiratory chain.The protein expression of CRT was significantly increased in high glucose group.However，compared with high glucose group，high glucose+ CRT siRNA decreased the expression of CRT and attenuated the damage of mitochondria，but CRT siRNA did not reduce the ROS level in cardiomyocytes.CONCLUSION: High glucose brings about CRT over-expression to induce mitochondrial injury，thus increasing myocardial apoptosis.

［KEY WORDS］High glucose; Calreticulin; Mitochondrial injury; Apoptosis

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者中存在的特異性心肌病變［1］，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增高，DCM已逐漸成為慢性心力衰竭發(fā)生的重要原因［2-4］。心肌細胞的凋亡被認為是DCM發(fā)生的重要病理生理機制，而線粒體是介導(dǎo)細胞凋亡的重要細胞器，在糖尿病患者及動物模型中可觀察到心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)、功能及動力學(xué)等的異常，提示DCM的發(fā)生、發(fā)展與心肌細胞線粒體損傷密切相關(guān)［5］。高血糖誘導(dǎo)線粒體損傷的機制目前尚不明確，可能與細胞氧化應(yīng)激損傷及Ca2+超載相關(guān)。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)是主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣結(jié)合蛋白，胚胎期高表達，參與維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、細胞黏附、蛋白折疊及細胞凋亡等［6］，另外CRT還參與調(diào)節(jié)線粒體膜電位及鈣離子穩(wěn)態(tài)的功能［7］。但CRT介導(dǎo)的線粒體損傷是否參與高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡尚不清楚。本研究通過高糖培養(yǎng)心肌細胞觀察CRT表達的變化對線粒體功能及細胞凋亡的影響。

材料和方法

1材料

AC-16人心肌細胞由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院地方病研究所譚武紅老師課題組惠贈; DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM低糖培養(yǎng)基(HyClone) ;四季青胎牛血清(浙江天杭) ; CRT單克隆抗體(Abcam) ; DCFHDA活性氧檢測探針和JC-1試劑盒(上海碧云天) ; Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒(BD) ;酶活性檢測試劑盒(南京建成) ; CRT siRNA (上海吉瑪基因，序列參照文獻設(shè)計［8］)序列為5’-GCAGACAAGCCAGGAUGCACGCUUU-3’，5’-AAAGCGUGCAUCCUGG CUUGUCUGC-3’;倒置相差顯微鏡(Olympus) ;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad) ;分光光度儀(上海天普) ;流式細胞儀(BD)。常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)與分組在含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素溶液的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)AC-16細胞至培養(yǎng)板的50%～60%，為減少血清對細胞生長的影響，給予無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)細胞分為4組，正常糖(normal glucose，NG)組:培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5.5 mmol/L;高糖(high glucose，HG) 組:培養(yǎng)基葡萄糖濃度為33 mmol/L; HG+ CRT siRNA組及等滲對照(isotonic control，IC)組: 5.5 mmol/L葡萄糖聯(lián)合27.5 mmol/L D-甘露醇培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。

2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將貼壁的AC-16細胞用0.25%胰酶消化，預(yù)冷的PBS溶液洗滌2遍，binding buffer重懸，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，取100 μL細胞加入5 μL FITC-Annexin V及5 μL PI工作液，避光室溫孵育15 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測。

2.3細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測按照1∶1 000濃度用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，將貼壁的AC-16細胞用0.25%胰酶消化，PBS洗滌細胞后用DCFH-DA溶液重懸細胞，37℃孵育20 min，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3遍，以除去未進入細胞的DCFH-DA，應(yīng)用流式細胞儀檢測。

2.4線粒體膜電位檢測將貼壁的AC-16細胞用0.25%胰酶消化，PBS洗滌細胞，培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，取0.5 mL單細胞懸液，加入0.5 mL JC-1染色工作液，細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細胞儀檢測，線粒體膜電位較高時呈現(xiàn)紅色熒光，線粒體膜電位較低時呈現(xiàn)綠色熒光。

2.5線粒體呼吸酶活性測定按照細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性檢測試劑盒說明書操作，選擇550 nm和600 nm波長于分光光度計分別檢測COX和SDH的活性。

2.6免疫細胞化學(xué)觀察CRT在心肌細胞的表達將潔凈的蓋玻片置于24孔板，按每孔1×104接種細胞。各組干預(yù)48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS溶液洗滌細胞2遍，4%多聚甲醛固定后轉(zhuǎn)移蓋玻片至載玻片上。滴加0.5% Triton打孔，3% H2O2消除過氧化物酶。正常山羊血清封閉37℃15 min后，將CRT單克隆抗體以1∶230稀釋，4℃孵育過夜;滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素，孵育條件均為37℃20min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0及光學(xué)顯微鏡進行圖片分析。以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準。每張切片觀察3個高倍視野，每個視野連續(xù)數(shù)50個細胞，其中陽性細胞數(shù)與總細胞百分比即為陽性細胞指數(shù)。

2.7免疫蛋白印跡測定細胞CRT含量使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，NanoDrop 2000測定蛋白質(zhì)濃度，計算50 μg蛋白量進行SDS-PAGE電泳，繼而轉(zhuǎn)印到PVDF膜，脫脂奶粉封閉后分別用CRT單克隆抗體(1∶3 000)及β-actin單克隆抗體(1∶3 000) 4℃孵育過夜，PBST洗滌后以相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL法顯影并用CCD相機拍照，采用UVP Software軟件分析。以β-actin作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，組間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1高糖對心肌細胞凋亡的影響

通過Annexin V-PI雙染法檢測心肌細胞凋亡可觀察到高糖組心肌細胞凋亡率較正常組明顯增加(P＜0.05) ;與高糖組相比，CRT siRNA可明顯減少高糖引起的心肌細胞凋亡增加(P＜0.05) ;與對照組相比，高滲組心肌細胞凋亡率無明顯增加，見圖1。

Figure 1.The apoptosis of AC-16 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖1各組心肌細胞的凋亡率

2高糖對心肌細胞ROS產(chǎn)生的影響

應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測活性氧探針DCFH-DA熒光強度，高糖使細胞內(nèi)ROS水平增加，熒光強度較正常糖濃度組升高(P＜0.05) ;而與高糖組相比，HG+ CRT siRNA組ROS水平有所降低，但差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組相比，高滲組心肌細胞內(nèi)ROS水平無明顯增加(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.The ROS production of AC-16 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖2各組心肌細胞內(nèi)的活性氧熒光強度

3高糖對心肌細胞線粒體膜電位的影響

應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位，高糖組中線粒體膜電位下降的細胞較線粒體膜電位正常的細胞明顯增多，相對于正常糖濃度組及等滲對照組差異顯著(P＜0.05) ;同時與高糖組相比，HG+ CRT siRNA組可以明顯降低線粒體膜電位下降心肌細胞的比例(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The mitochondrial membrane potential (MMP) level of AC-16 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖3心肌細胞線粒體膜電位的變化

4高糖對心肌細胞呼吸酶活性的影響

與正常糖濃度組及等滲對照組相比，高糖組線粒體膜COX及SDH的活性明顯降低(P＜0.05) ; HG+ CRT siRNA可以顯著改善高糖引起的線粒體呼吸酶活性的下降(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The COX and SDH activity of AC-16 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group.圖4各組心肌細胞COX及SDH的活性

5高糖誘導(dǎo)心肌細胞CRT表達

正常糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細胞僅見少量CRT表達，高糖誘導(dǎo)心肌細胞CRT表達升高，高糖組陽性細胞指數(shù)明顯高于正常糖組(P＜0.05) ;與高糖組及對照組相比，HG+ CRT siRNA組中CRT表達明顯降低(P＜0.05) ;與對照組相比，高滲條件僅引起CRT表達輕度升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

6高糖對心肌細胞CRT表達水平的影響

為量化心肌細胞內(nèi)CRT表達水平，對提取的心肌細胞總蛋白進行蛋白免疫印跡檢測并進行灰度分析，與正常糖濃度組相比，HG+ CRT siRNA組及等滲對照組CRT蛋白的表達僅有輕微變化，差異不顯著(P＞0.05)，而高糖組CRT蛋白表達水平明顯升高，差異顯著(P＜0.05)。

討論

DCM是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，是患者出現(xiàn)慢性心力衰竭及心血管病死亡的重要原因［3］。心肌細胞凋亡在DCM發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，研究表明，線粒體功能異?？赡軈⑴c高糖引起的心肌細胞凋亡［9］。本研究通過在高糖環(huán)境中體外培養(yǎng)AC-16心肌細胞發(fā)現(xiàn)高糖導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS生成的增加、線粒體膜電位的下降及線粒體COX和SDH酶活性的下降，并伴隨著心肌細胞凋亡增加，提示線粒體功能障礙可能參與高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)心肌細胞中CRT表達升高，同時應(yīng)用siRNA抑制高糖誘導(dǎo)的細胞內(nèi)CRT高表達時可以緩解心肌細胞線粒體損傷，降低心肌細胞的凋亡率。結(jié)合既往研究證據(jù)我們可以推測CRT過表達介導(dǎo)的線粒體功能障礙可能參與高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

Figure 5.The expression of CRT in AC-16 cardiomyocytes (immunocytochemical staining，×400).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group;#P＜0.05 vs HG group.圖5各組心肌細胞CRT的表達

Figure 6.The expression of CRT in AC-16 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NG group;#P＜0.05 vs HG group.圖6各組心肌細胞CRT的表達水平

CRT是KDEL家族蛋白成員，正常狀態(tài)下CRT合成后滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)［10］。CRT對于心臟發(fā)育有著重要意義，CRT敲除小鼠胚胎期出現(xiàn)室壁厚度減低、室壁缺損等并導(dǎo)致死亡［11］;出生后CRT表達降低，當(dāng)CRT過度表達時誘導(dǎo)心肌細胞肥大［12-13］，導(dǎo)致心律失常、心腔擴大、心源性猝死等出現(xiàn)［14］。另外，尚有一些報道提示鈣網(wǎng)蛋白與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)，陳光獻等［15］發(fā)現(xiàn)缺血再灌注時CRT表達升高，應(yīng)用遠程預(yù)處理模擬缺血預(yù)處理下調(diào)CRT的表達可減輕缺血再灌注損傷。因此CRT在心血管疾病發(fā)病中的作用越來越受到研究者的重視。本研究中我們通過高糖培養(yǎng)心肌細胞并運用免疫細胞化學(xué)及Western blot對CRT表達進行檢測，證實在高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡模型中CRT表達增加，提示CRT可能參與高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的病理生理過程。Arnaudeau等［7］研究證實在He-La細胞中CRT可降低線粒體中Ca2+濃度進而導(dǎo)致線粒體膜電位下降、線粒體跨膜轉(zhuǎn)運異常進而引起線粒體功能降低。課題組前期建立了呋喃唑酮誘導(dǎo)的擴張型心肌病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)擴張型心肌病大鼠心肌線粒體功能異常并出現(xiàn)心肌組織CRT表達升高，伴隨信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)磷酸化過程受阻;下調(diào)CRT表達可以緩解線粒體損傷及STAT3磷酸化過程受阻，提示CRT的過表達亦可通過抑制STAT3磷酸化介導(dǎo)線粒體功能的受損［16］。本研究中高糖誘導(dǎo)心肌細胞CRT過表達時伴有線粒體損傷，而通過CRT siRNA降低高糖誘導(dǎo)的CRT過表達的同時線粒體損傷有所減輕且細胞凋亡率明顯下降，提示CRT介導(dǎo)的線粒體損傷與細胞凋亡密切相關(guān)。另外，CRT可通過ROS生成等影響線粒體功能，并且Ihara等［17］指出，H9c2細胞CRT高表達可以增加細胞對H2O2的敏感性，提示H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡中CRT過表達是關(guān)鍵性的因素。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的心肌細胞中CRT表達增加、活性氧生成增加呈現(xiàn)一致性改變，同時抑制CRT表達并不能減少細胞內(nèi)活性氧的生成，因此我們推測高糖環(huán)境使得心肌細胞活性氧生成增加，并促進CRT過表達進而導(dǎo)致線粒體損傷，線粒體Ca2+調(diào)節(jié)異常，MPTP開放，細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等釋放，介導(dǎo)心肌細胞凋亡，但CRT異常表達導(dǎo)致線粒體損傷的具體機制仍需進一步探討。

綜上所述，高糖條件下，CRT表達增加誘導(dǎo)心肌線粒體損傷可能是心肌細胞凋亡增加的重要原因。本研究為揭示糖尿病心肌病心肌線粒體損傷提供新的理論依據(jù)，為糖尿病心肌病發(fā)病機制的闡明奠定了理論基礎(chǔ)。

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通訊作者△Tel: 029-87679770; E-mail: weijin@ mail.xjtu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81170209; No.30771862)

［收稿日期］2014-11-10

［文章編號］1000-4718(2015)06-0967-06

［中圖分類號］R541.8; R363

［文獻標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.002