陳 剛，孫春紅，閆柏剛

自噬(autophagy)是由Ashford和Porter［1］在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出，系指由細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體等脫落的雙層膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)和受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，而后與溶酶體融合降解其所包裹內(nèi)容物，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新［2］。據(jù)研究［3-5］，自噬在細(xì)胞生長發(fā)育中起重要作用，且在各種應(yīng)激及疾病如缺血缺氧性損害、腫瘤、神經(jīng)退化等病理過程中也扮演著至關(guān)重要的角色。嚴(yán)重?zé)齻騽?chuàng)傷后易發(fā)生失血性休克，導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，為保證心腦血管等重要臟器血流供應(yīng)，機(jī)體常出現(xiàn)代償反應(yīng)，即血液重分布，在血液重分布情況下腸道又是最常受累的器官，由腸道組織灌流不足、氧需求增加及高代謝所造成的缺氧，導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)與功能受損。缺血缺氧所致胃腸道上皮細(xì)胞的自噬情況目前研究甚少，本研究利用體外缺氧模型模擬胃腸道缺血缺氧，動態(tài)觀察Caco-2腸上皮細(xì)胞在缺氧條件下的自噬變化情況，旨在了解缺氧對腸上皮細(xì)胞自噬的影響，為研究自噬在缺氧后腸上皮損害中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

Caco-2腸上皮細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供，P62抗體、Beclin1抗體、β-肌動蛋白(βactin)抗體購自美國SIGMA公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗為美國Southern Biotech公司產(chǎn)品，綠色熒光蛋白(GFP)-LC3B由第三軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)藥中試研究基地唐彬博士贈送，改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)及還原血清培養(yǎng)基(OPTI-MEM)均購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自BBI公司，常氧培養(yǎng)箱和缺氧培養(yǎng)箱均購自美國Thermo Scientific公司，超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒為Advansta公司產(chǎn)品，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為Millipore公司產(chǎn)品，蛋白印跡相關(guān)試劑﹑蛋白測定試劑盒﹑電轉(zhuǎn)儀﹑電泳儀及ChemiDoc XRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司，UD-201型組織細(xì)胞超聲破碎儀購自日本TOMY公司，冷凍離心機(jī)AllegraTMX-22R購自美國Beckman公司，TCS SPS型激光共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產(chǎn)品，H-600型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

Caco-2細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(FBS)、100μg/mL鏈 霉 素、100U/mL青 霉 素、2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、pH7．4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至約90%融合時，用25g/L胰蛋白酶及0．53mmol/L乙二胺四乙酸液消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于6孔板，隔天更換培養(yǎng)液，直到細(xì)胞完全融合。將細(xì)胞接種于含蓋玻片(鼠尾膠原包被)的24孔板，到細(xì)胞貼壁后處理。

細(xì)胞缺氧處理按照文獻(xiàn)方法［6］進(jìn)行，將細(xì)胞完全融合的6孔板放入缺氧培養(yǎng)箱中，充入由體積分?jǐn)?shù)為1%O2、5%CO2和94%N2組成的混合氣體(重慶朝陽氣體廠)，放置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)缺氧時間不同將細(xì)胞分為常氧組(缺氧0h)，缺氧(0．5、1、2、6、12、24h)組。將鼠尾膠原包被蓋玻片的24孔板分為常氧組(正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h)和缺氧6h組。

3 檢測指標(biāo)與方法

3.1 腸上皮細(xì)胞Beclin1、P62和LC3蛋白表達(dá)的檢測 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法［7］檢測，以β-actin作內(nèi)參，方法簡述如下:用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞后即加入細(xì)胞裂解液放置冰上低溫裂解細(xì)胞，收集樣本于1．5mL尖底離心并用細(xì)胞超聲破碎儀破碎，離心(12 000r/min、10min、4℃)，取上清液煮沸5min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后分別加入兔抗Beclin1抗體、兔抗P62抗體、兔抗LC3抗體及鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過夜。次日以吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)洗膜4次后分別加入二抗HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜4次后加入化學(xué)發(fā)光液，用凝膠圖像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號。Quantity One軟件對蛋白表達(dá)行相對定量分析，Beclin1及P62蛋白表達(dá)量分別以Beclin1或P62與LC3Ⅰ蛋白的比值表示，LC3蛋白表達(dá)量以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值表示。

3.2 透射電鏡檢測自噬 用細(xì)胞刮常規(guī)收集6孔板貼壁細(xì)胞，置于尖底離心管離心(1 000r/min、8min)，吸去上清液，加入2．5%戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)，4℃固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。再于1%鋨酸固定液固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。乙醇梯度脫水后用環(huán)氧樹脂和丙酮等體積混合滲透過夜，聚合器中聚合，環(huán)氧樹脂618包埋，半薄切片定位、超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，置于H-600型透射電鏡下觀察并拍照。

3.3 GFP-LC3B融合蛋白示蹤自噬體形成 擴(kuò)增GFP-LC3B融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒DNA并用紫外分光光度儀測定其濃度與純度后備用。將細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上，待其生長24h后，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書的方法進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞分別置于常氧培養(yǎng)箱及缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6h后用PBS漂洗5min，1%多聚甲醛(PFA)固定30min，PBS漂洗3次(5min/次)后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，以ˉx±s(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間均數(shù)比較運(yùn)用單因素方差分析，P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0．01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3蛋白表達(dá)的變化

如圖1、2、3免疫印跡結(jié)果及表1定量分析結(jié)果所示，與正常對照(0h)相比較，缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1及LC3蛋白表達(dá)均呈逐漸增加趨勢，且均在缺氧后12h蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，至缺氧后24h蛋白表達(dá)雖有所回落，但仍顯著高于正常對照。P62蛋白表達(dá)在缺氧后進(jìn)行性降低，至缺氧后24h降至最低。

圖1 缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)的變化

圖2 缺氧后腸上皮細(xì)胞P62蛋白表達(dá)的變化

圖3 缺氧后腸上皮細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的變化

表1 缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1、P62和LC3蛋白表達(dá)定量分析結(jié)果(ˉx±s)

2 缺氧后自噬溶酶體的變化

自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，直接觀察自噬體需在透射電子顯微鏡下。因此，透射電鏡觀察是目前確認(rèn)是否發(fā)生自噬的最重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)，被認(rèn)為是檢測是否發(fā)生自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。筆者也利用透射電鏡觀察了缺氧對腸上皮細(xì)胞自噬溶酶體變化的影響。由于上述自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62及LC3蛋白表達(dá)均在缺氧后6h與正常對照有顯著差異，因此我們觀察了缺氧后6h腸上皮細(xì)胞自噬溶酶體的變化情況。圖4的結(jié)果表明，與正常對照相比較，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)目明顯增多(圖中箭頭所示)，表明缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

圖4 缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬溶酶體的變化

3 缺氧后GFP-LC3B融合蛋白示蹤的變化

GFP-LC3B融合蛋白示蹤技術(shù)的原理是利用LC3B在自噬形成過程中發(fā)生聚集這一現(xiàn)象，無自噬時GFP-LC3B融合蛋白彌散地分布于胞漿內(nèi);發(fā)生自噬時GFP-LC3B融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜聚集，在熒光顯微鏡下可觀察到多個明亮的綠色熒光斑點(diǎn)。筆者采用GFP-LC3B融合蛋白示蹤方法觀察了缺氧后6h腸上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生情況，圖5的結(jié)果表明，正常對照的腸上皮細(xì)胞內(nèi)分布較均勻一致的綠色熒光，而熒光斑點(diǎn)形成較少;缺氧后6h的腸上皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)形成明顯增多，表明缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬明顯增加。

圖5 缺氧后GFP-LC3B融合蛋白示蹤的變化

討 論

嚴(yán)重?zé)齻缙谧钪饕牟±砩碜兓癁榇罅矿w液滲出，有效循環(huán)血量銳減，使機(jī)體處于休克狀態(tài)，導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，故嚴(yán)重?zé)齻缙谌硇該p害的實(shí)質(zhì)是組織器官的缺血缺氧性損害。有資料表明［8］，腸系膜血管的血管緊張素受體密度比其他部位高，故對血管加壓素敏感性高，休克時腸系膜血流量顯著減少，而機(jī)體為了保證心腦等重要臟器的血流灌注，通過血流重分布方式“犧牲”腸道等相對不重要器官的血流以維持心腦等血流灌注，這就使得腸道等的血流灌注量更進(jìn)一步降低，導(dǎo)致腸道黏膜缺血缺氧。既往的研究表明［9］，嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r腸黏膜組織結(jié)構(gòu)損害、腸道屏障功能受損及通透性增加，引起腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素移位。但是，迄今為止，嚴(yán)重?zé)齻缙谀c黏膜損害的機(jī)制仍不完全清楚。

近年來，自噬在組織缺血缺氧性損害中的作用已受到廣泛關(guān)注。據(jù)國外文獻(xiàn)報道［10-11］，在缺氧時結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)增加及P62表達(dá)降低，表明缺氧后細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)。在小鼠模擬急進(jìn)高原實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［12］，急進(jìn)高原組小鼠腸道機(jī)械屏障受損傷且腸道上皮細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin1表達(dá)升高，但自噬作用的上調(diào)與腸道機(jī)械屏障損傷的關(guān)系目前尚不明確。筆者最近的研究也發(fā)現(xiàn)［13］，在小鼠嚴(yán)重?zé)齻缙?，重要臟器如心、肝、肺、腎組織的自噬標(biāo)志分子Beclin1及LC3蛋白表達(dá)升高，自噬溶酶體增多，表明嚴(yán)重?zé)齻梢鸾M織細(xì)胞自噬增加。腸道作為應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，缺血缺氧時腸黏膜上皮細(xì)胞自噬是否也增加呢?目前的研究資料尚不能明確回答這一問題。為此，本實(shí)驗(yàn)利用體外缺氧模型，研究了缺氧條件下人腸上皮細(xì)胞自噬的動態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸上皮細(xì)胞在缺氧0．5h后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)水平均開始增加，且隨著缺氧時間的延長而進(jìn)一步增加，到缺氧12h達(dá)到峰值，至24h雖有回落，但仍顯著高于正常水平。與此相反，另一種自噬相關(guān)蛋白P62的蛋白表達(dá)則隨著缺氧時間的延長逐漸降低，到缺氧24h時降至最低。過去的研究表明［14］，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及P62均在自噬的發(fā)生與發(fā)展中起著非常重要的作用，被認(rèn)為是細(xì)胞自噬形成的標(biāo)志性分子。Beclin1蛋白與自噬過程中形成吞噬小泡的起始密切相關(guān);LC3定位在自噬體雙層膜的整個延長階段，且貫穿整個自噬過程;P62在自噬過程中作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬，但在自噬晚期被逐漸降解。很顯然，本實(shí)驗(yàn)觀察到的缺氧后Beclin1與LC3蛋白表達(dá)增加及P62蛋白表達(dá)降低表明了缺氧狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的透射電鏡結(jié)果也表明，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)目增加;進(jìn)一步的GFP-LC3B融合蛋白示蹤結(jié)果更是表明，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)形成明顯增多，即自噬溶酶體增加，這些均與上述缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1、LC3及P62這三種自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化趨勢相吻合。因此，綜合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，筆者認(rèn)為缺氧能引起腸上皮細(xì)胞自噬明顯增強(qiáng)。

目前的研究認(rèn)為，自噬在機(jī)體的各種生命活動中發(fā)揮著重要作用，適度的自噬可加速細(xì)胞新陳代謝及細(xì)胞器更新，參與缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但過度的自噬則引起自噬性細(xì)胞死亡，導(dǎo)致組織損害［4-14］。因此，自噬究竟是起保護(hù)性作用，還是損傷性作用，目前還存在較大的爭議。近期有研究發(fā)現(xiàn)，特異性抑制嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r心肌細(xì)胞的自噬，能明顯減少心肌細(xì)胞過度死亡，減輕心功能損害，表明心肌細(xì)胞自噬增加參與了嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r心肌組織功能損害的發(fā)生［15］。過去的研究表明，缺氧可引起培養(yǎng)的人腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白發(fā)生改變，導(dǎo)致緊密連接屏障功能損害［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的缺氧能引起腸上皮細(xì)胞自噬水平明顯增強(qiáng)，是否與缺氧后腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白改變及屏障功能損害有關(guān)，目前尚難以明確，筆者將對此進(jìn)行深入研究。

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