逆流法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型*

王哲1路芳2#（1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南250011；2山東中醫(yī)藥大學(xué) 濟(jì)南250014）

目的：通過與種植法建模對比，探討逆流法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的可行性及建模成功率。方法：研究分逆流組、種植組、空白組，分別進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后8周觀察組織形態(tài)變化并采靜脈血檢測EMAb、CA125，判定成模情況。結(jié)果：逆流組成模率為70%，種植組成模率90%。結(jié)論：逆流法建模成功，但成模率較種植法稍低。

子宮內(nèi)膜異位癥；動物模型；逆流法

子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）的難治性及復(fù)雜性逐漸引起臨床醫(yī)師的關(guān)注，但由于人體研究的局限性，動物模型為內(nèi)異癥病理生理的研究、治療方法的探索提供了一個很好的載體。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠內(nèi)異癥模型與人類內(nèi)異癥在許多方面有相似和相近之處。我們用手術(shù)逆流的方法建立大鼠EMT模型，并對模型進(jìn)行組織學(xué)觀察及生化指標(biāo)檢測以評價造模成功與否，為臨床發(fā)病機(jī)理及治療方法的研究提供更好的支持。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 健康性成熟6～9周齡雌性未交配wistar大鼠，體重160～190 g，由山東大學(xué)動物實驗中心提供。許可證號：SCXK（魯）20090001。

1.1.2 藥物 水合氯醛；注射用青霉素鈉（國藥準(zhǔn)字H37020079，批號：S130401）；戊酸雌二醇（國藥準(zhǔn)字J20080036，批號：202A2）。

1.2 方法

1.2.1 分組 逆流組（逆流建模）、種植組（種植建模）、空白組（正常對照組）各10只。

1.2.2 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前1 d給予造模大鼠灌服戊酸雌二醇，劑量為0.5 mg/kg，使手術(shù)時大鼠統(tǒng)一處于發(fā)情期。

1.2.3 模型制作 逆流組：以10%水合氯醛（300mg/kg，腹腔注射）麻醉，然后將大鼠固定于手術(shù)板上，腹部剪毛，常規(guī)消毒，在尿道口上約1 cm處切長1.5～2.0 cm的縱形切口進(jìn)腹。暴露雙側(cè)子宮、輸卵管、卵巢，于子宮近輸卵管l cm處行5 mm縱向切口，用特制毛刷搔刮子宮內(nèi)膜8周，6-0腸線縫合切口，用眼科無齒平鉗夾閉子宮下段，將2 ml生理鹽水經(jīng)子宮輸卵管注入腹腔，使子宮內(nèi)膜組織逆行入盆腔，逐層縫合皮膚和皮下組織。種植組：開腹方式同逆流組，開腹后，分離左側(cè)子宮，結(jié)扎兩端子宮及子宮系膜血管，切除長1.5～2.0 cm的子宮段，立即放入生理鹽水中，修剪去子宮漿膜外的脂肪組織，縱向切開子宮腔，剝?nèi){膜層及肌層，切取5 mm×5 mm的片段，分別以6-0號絲線將內(nèi)膜縫合于右側(cè)子宮、右側(cè)卵巢及輸卵管周圍的脂肪組織、腹壁血管豐富處、皮下，逐層縫合皮膚和皮下組織。兩組大鼠術(shù)后自然蘇醒，分籠單放，常規(guī)飼養(yǎng)?？瞻捉M：不手術(shù)，正常飼養(yǎng)。

1.2.4 術(shù)后用藥 術(shù)后逆流組、種植組大鼠連續(xù)5 d灌服戊酸雌二醇0.1 mg/kg，腹腔注射青霉素16萬U/kg。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 抽血后，處死大鼠，立即解剖，觀察異位包塊情況，取異位內(nèi)膜包塊、在位子宮即逆流組、種植組左側(cè)子宮中段及對照的空白組大

鼠子宮的一段，甲醛固定，常規(guī)制片，HE染色，在光鏡下觀察在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)學(xué)特點及差異。

1.3.2 生化指標(biāo) 術(shù)后8周，抽取大鼠腹主動脈血2 ml，用ELISA法檢測血清中EMAb（antiendometrial antibody，抗子宮內(nèi)膜抗體），CA125（cancer antigen 125，癌抗原125）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用方差分析，結(jié)果以（x±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 術(shù)后第8周，解剖后見異位內(nèi)膜包塊大小不等，最大的為10.00 mm×9.76 mm，最小的為2.30 mm×2.20 mm，包塊為囊狀，內(nèi)有積液感，逆流組10只模中有3只未形成囊狀，建模成功率為70%；種植組10只模中有1只未形成囊狀，建模成功率為90%。種植組成模大鼠異位內(nèi)膜出現(xiàn)于腹壁5只、卵巢及輸卵管4只、皮下2只；逆流組異位內(nèi)膜出現(xiàn)于腹壁4只、卵巢及輸卵管3只、皮下1只。光鏡下空白組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列完整，肌層較厚，結(jié)構(gòu)完整，腺體和血管豐富。逆流組與種植組在位及異位內(nèi)膜的上皮細(xì)胞扁平，呈長柱狀或增生呈假復(fù)層結(jié)構(gòu)，大部分有分泌現(xiàn)象，少數(shù)可見腺體分布，肌層較薄，結(jié)構(gòu)不清。見圖1～圖3。

2.2 生化指標(biāo)比較 各組之間CA125（F=113.407）、EMAb（F=96.449）均有明顯差異（P＜0.05），且種植組、逆流組、空白組依次降低（P＜0.05）。見表1。

3 討論

3.1 造模方式 手術(shù)移植法是目前國內(nèi)外報道的建立EMT模型的主要方法。對模型動物的選擇，多選用大鼠與兔，該實驗選擇大鼠，是因為大鼠的激素水平較高，性周期短且規(guī)律，對造模的成功及觀察較為有利且較經(jīng)濟(jì)。該研究采用逆流法模擬人體的經(jīng)血逆流原理造模，更貼近于臨床發(fā)病實際，且手術(shù)操作簡單。實驗時手術(shù)應(yīng)做到以下幾點：（1）在手術(shù)前24 h給大鼠灌服戊酸雌二醇，人為的使大鼠在手術(shù)時統(tǒng)一在發(fā)情期。術(shù)中，剖開大鼠腹腔后可見大鼠的子宮均處于充盈狀態(tài)，方便手術(shù)的進(jìn)行。（2）逆流手術(shù)時，分離子宮，將子宮內(nèi)膜搔刮，接著用生理鹽水將其沖入盆腔，縮短了手術(shù)時間。子宮內(nèi)膜異位癥可出現(xiàn)在身體的不同部位，但絕大多數(shù)位于盆腔內(nèi)的卵巢、宮底韌帶、子宮下部后壁漿膜面及覆蓋直腸子宮凹陷、乙狀結(jié)腸的腹膜層[1]。本實驗?zāi)M人體的經(jīng)血逆流將搔刮后的子宮內(nèi)膜逆流沖入盆腔，可以觀察子宮內(nèi)膜異位癥的多發(fā)部位。逆流組及種植組異位內(nèi)膜均多出現(xiàn)于腹壁，其次為卵巢及輸卵管，最后為皮下。手術(shù)中保持無菌，使進(jìn)行造模的大鼠無1只發(fā)生術(shù)后感染；術(shù)后1周，切口已經(jīng)完全愈合。3.2 觀察指標(biāo)

3.2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 簡單可行，同時測量異位灶的大小，將其量化，更能夠準(zhǔn)確判斷其成模情況，逆流組與種植組均出現(xiàn)內(nèi)異癥病灶，逆流組較種植組組織大體觀及鏡下觀均顯示成模率低，但仍有70%建模成功。

3.2.2 生化指標(biāo) EMAb[2]是以子宮內(nèi)膜為靶抗原，并引起一系列免疫病理效應(yīng)的自身抗體。目前EMAb被認(rèn)為是EMT標(biāo)志性抗體，文獻(xiàn)[3]報道EMT患者中EMAb的檢出率可達(dá)70%～80%。CA125是腫瘤標(biāo)記物的一種，是一種高分子量的糖蛋白抗原，主要來自分泌期子宮內(nèi)膜，內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生CA125的量代表細(xì)胞的增活性。有文獻(xiàn)資料報道了血清CA125測定對內(nèi)異癥有較理想的診斷價值[4～6]。研究報道血清CA125與EMAb聯(lián)合測定可在敏感性下降不多的情況下，明顯提高特異性；同時如兩者均陽性，EMT的診斷基本成立；兩者均陰性診斷基本不成立[7]。因此通過聯(lián)合檢測血CA125、EMAb的變化可以較準(zhǔn)確的反映子宮內(nèi)膜異位癥的成模情況。本研究中逆流組較種植組血清CA125與EMAb均低，但較空白組明顯升高，證實逆流法建模成功。

3.3 原因分析 該研究中逆流法成模率較種植法稍低，考慮以下原因：（1）大鼠輸卵管組織較細(xì)，子宮內(nèi)膜組織不能夠完全通過子宮輸卵管進(jìn)入盆腔；（2）大鼠免疫功能強(qiáng)大，到達(dá)盆腔的部分子宮內(nèi)膜組織可被吞噬而不形成內(nèi)異癥；（3）搔刮過程中脫落的子宮內(nèi)膜組織的數(shù)量致成模率低。

經(jīng)血逆流法制造子宮內(nèi)膜異位癥模型較種植法成模率稍低，但經(jīng)血逆流法操作更簡單、手術(shù)時間短、創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)快，避免了實驗中手術(shù)因素導(dǎo)致的差異。該實驗手術(shù)均是對宮腔操作，可以在不開腹的情況下完成，對以后實驗應(yīng)用于大型動物如猿猴等的研究提供了新的造模方法；同時對于其他學(xué)說所致子宮內(nèi)膜異位癥也可以提供借鑒。該過程更符合人體發(fā)病的自然過程，為以后臨床中研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)理及治療提供了新的方法，也拓寬了臨床研究的思路。但該實驗僅考慮經(jīng)血逆流種植因素，其他方面的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1]樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010.325

[2]關(guān)坤萍,賈克麗,郭慧芳.細(xì)胞凋亡基因p53在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)[J].中國藥物與臨床,2008,8(10):794-795

[3]陳瓊?cè)A,曲軍英,邱娜漩,等.MMP9,TIMP1及VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜的表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床2004,24(4):418-420 [4]Kalu E,Sumar N,Giannopoulos T,et al.Cytokine profiles in serum and peritoneal fluid from infertile women with and without endometriosis [J].J Obstet Gynaecol Res,2007,33(4):490-495

[5]巫云.血清CA125檢測對子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診斷價值[J].交通醫(yī)學(xué),2003,17(5):535

[6]曹立幸,韓冰,李同璽,等.婦痛寧對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥CA125水平影響的實驗研究[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,13(5):31-32

[7]劉桂蘭,石晶,王芳芳,等.抗子宮內(nèi)膜抗體與CA125對于子宮內(nèi)膜異位癥的診斷價值[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2014,25(2):129-131（收稿日期：2014-12-05）

Establishing Ratendometriosis Model with Reflux Method

WANG Zhe1,LU Fang2(1Shandong University Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jinan250011;
2Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan250014)

Objective:To discuss the feasibility and success rate of establishing the rat endometriosis model by comparing reflux method with planting method.Method:Lab rats were divided randomly into three groups:reflux group,planting group and control group. Each group were given surgery respectively and tissue morphological variations and EMAb and CA125 in venous blood were observed and tested 8 weeks afterward to compare the conditions of each group.Results:The success rate of reflux model was 70%,and the rate of planting model was 90%.Conclusion:Modeling with reflux method can achieve high success rate but the rate is lower than modeling with planting method.

Endometriosis;Animal models;Reflux method

R614.42

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.06.002

山東省中醫(yī)藥科學(xué)研究項目（編號：2010-093）#通訊作者：路芳，E-mail：zplufang@163.com