鄧慧華

(龍巖市林業(yè)科學研究所，龍巖，364000)

植物內(nèi)生真菌泛指那些在其生活史中的某一階段或在整個生活史中都生活在植物組織內(nèi)部，但并沒有引起植物組織明顯病害癥狀的一類真菌［1-2］。其普遍存在于各種植物體內(nèi)，分布在植物根、莖、葉等器官表皮下的組織中，與宿主植物在長期演化中互惠互利，共同生長［3］。近些年來，前人進行了很多關(guān)于內(nèi)生真菌的研究［4-5］，內(nèi)生真菌應(yīng)用價值逐漸引起人們的重視。

馬尾松(Pinus massoniana)是我國松屬樹種中分布最廣的重要用材樹種，富含松脂，是中國主要的產(chǎn)脂樹種。有關(guān)馬尾松內(nèi)生真菌的研究鮮見報道。筆者曾對馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株及其產(chǎn)油脂效果進行研究［6-7］。筆者對馬尾松進行內(nèi)生真菌的分離純化，通過形態(tài)學鑒定確定馬尾松內(nèi)生真菌的種類及其在各組織中的分布，并分析馬尾松內(nèi)生真菌的生物多樣性，為豐富馬尾松內(nèi)生真菌資源提供依據(jù)，為馬尾松內(nèi)生真菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

馬尾松樣品來源:馬尾松樣品采自福建省漳平五一國有林場。采樣時挑選生長性狀良好、無病蟲害癥狀的健康植株，分根、莖、葉進行采集。根、莖采集10 cm 以上的條段，樣品從植株分離后，用沾水的棉花包住傷斷處，裝于密封的塑料袋中，帶回實驗室于冷藏箱中低溫保鮮備用。

培養(yǎng)基的配方及制作:PDA 固體培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸20～30 min，4層紗布過濾。加入葡萄糖20 g，瓊脂18 ～20 g，繼續(xù)加熱攪拌混勻，補足水分定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

內(nèi)生真菌的分離:采用組織塊法分離內(nèi)生真菌［8-9］。將馬尾松根、莖和葉分別剪成3 ～5 cm 的小段，用蒸餾水沖洗干凈后，無菌條件下用75%乙醇表面消毒2～5 min，再將樣品放人0．1%的升汞溶液中進一步消毒10～30 s，最后用無菌水沖洗3 次。用無菌吸水紙吸干表面水分，用刀片將根和莖切成0．3～0．5 cm2小塊，將葉切成0．3 cm 的小段，接入PDA 培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中27 ℃避光培養(yǎng)3～7 d。

內(nèi)生真菌的純化:采用菌絲頂端純化法［10-11］，待組織塊周圍長出菌絲，挑取尖端部分轉(zhuǎn)接至新的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上，逐步純化獲得純培養(yǎng)。將分離純化后的菌株接種于固體斜面PDA 培養(yǎng)基上，對菌株進行編號，保存?zhèn)溆茫?2］。

菌種鑒定:主要根據(jù)宏觀的菌落特征、微觀的個體特征及一些生物學特性，對分離到的馬尾松內(nèi)生真菌進行形態(tài)學分類［13］。挑取純化的真菌菌絲，接種于PDA 培養(yǎng)基上，采用3 點接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征;采用點植法或載玻片培養(yǎng)法等制成玻片，置于光學顯微鏡下觀察菌種在培養(yǎng)過程中菌絲形態(tài)、個體發(fā)育、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)等特征，參照《真菌鑒定手冊》［14］及有關(guān)資料對其進行鑒定，確定真菌的分類學地位。

2 結(jié)果與分析

2．1 馬尾松內(nèi)生真菌的分離鑒定及多樣性

經(jīng)表面消毒和分離純化，從采集的馬尾松根、莖、葉樣品中共分離到102 株內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學觀察和鑒定，初步將其鑒定為11 個屬，分屬于6 科6 目4 綱3 門。其種類組成及菌落形態(tài)特征見表1。由表1 可以看出，分離到的馬尾松內(nèi)生真菌中毛霉屬(Mucor)屬于接合菌亞門(Zygomycotina)，生赤殼屬(Bionectria)屬于子囊菌門(Ascomycota)，其余9個屬歸屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，分別分屬于絲孢綱(Hyphomycetes)和腔孢綱(Coelomycetes)。其中絲孢綱(Hyphomycetes)最多，包括叢梗孢目(Moniliales)、叢梗孢科(Moniliaceae)的木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、叢梗孢屬(Monilia)、曲霉屬(Aspergillus);絲孢目(Hyphomycetales)、絲孢科(Hyphomycetaceae)的擬青霉屬(Paecilomyces);瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)的鐮刀菌屬(Fusarium)，共6個屬;腔孢綱(Coelomycetes)3 個屬，為球殼孢目(Sphaeropsidales)、球殼孢科(Sphaeropsidaceae)的莖點霉屬(Phoma)、擬莖點霉屬(Phomopsis)和葉點霉屬(Phyllosticta)。

表1 馬尾松內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

2．2 馬尾松不同器官上的內(nèi)生真菌的分布

內(nèi)生真菌在馬尾松不同器官組織的菌株數(shù)量和涉及屬的數(shù)目情況見表2。

表2 馬尾松不同器官內(nèi)生真菌菌株數(shù)量

馬尾松內(nèi)生真菌在根、莖、葉中均有分布。從馬尾松的根部分離到12 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的11．76%，涉及6 個屬，占總屬數(shù)的54．55%;從莖部分離到23 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的22．55%，涉及9個屬，占總屬數(shù)的81．82%;從葉部分離到67 株內(nèi)生真菌，占總菌株數(shù)的65．69%，涉及11 個屬，占總屬數(shù)的100%。結(jié)果表明，從葉部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量和涉及屬的數(shù)目最多，莖部次之，從根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量和涉及屬的數(shù)目均為最少。

馬尾松內(nèi)生真菌在不同器官的種群分布情況見表3。在分離出的102 株馬尾松內(nèi)生真菌中，毛霉屬30 株，占總菌株數(shù)的29．41%，在根、莖、葉中的分布分別為4、6、20 株;木霉屬24 株，占總菌株數(shù)的23．53%，在根、莖、葉中的分布分別為3、8、13 株。毛霉屬和木霉屬為馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢屬。曲霉屬11 株，占總菌株數(shù)的10．78%，在根、莖、葉中的分布分別為2、2、11 株;擬莖點霉屬9 株，占總菌株數(shù)的8．82%，在根、莖、葉中的分布分別為1、0、8 株;莖點霉屬8 株，占總菌株數(shù)的7．84%，在根、莖、葉中的分布分別為0、2、6 株;青霉屬5 株，占總菌株數(shù)的4．90%，在根、莖、葉中的分布分別為0、2、6 株。曲霉屬、擬莖點霉屬、莖點霉屬和青霉屬是馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢屬。其余屬菌株數(shù)相對較少，為非優(yōu)勢屬。

表3 馬尾松不同器官內(nèi)生真菌的種群分布情況

從表3 可以看出，分離出的馬尾松內(nèi)生真菌11個屬中，毛霉屬、木霉屬、青霉屬、曲霉屬在根、莖、葉中均有分布;叢梗孢屬、擬青霉屬、莖點霉屬、生赤殼屬、葉點霉屬在莖和葉部有分布，在根部無分布;鐮刀菌屬、擬莖點霉屬在根和葉部有分布，在莖部無分布。各個屬在葉部的分布均為最多。

3 討論

對馬尾松的根、莖、葉部內(nèi)生真菌的分離鑒定和多樣性分析表明，馬尾松內(nèi)生真菌的種類具有多樣性，在不同器官上的種群和數(shù)量分布也具有豐富的多樣性，但不同器官的內(nèi)生真菌在數(shù)量和種群分布上都存在較大差異。由葉分離出的內(nèi)生真菌株數(shù)和屬的數(shù)量都高于根和莖部分。這與其他樹種內(nèi)生真菌的相關(guān)研究結(jié)果存在差異［15］。宋萍等［16］對雷公藤(Tripterygium wilfordii)植物內(nèi)生真菌進行分離，從植株枝中分離到的菌株數(shù)量高于根和葉;高智輝等［17］從從核桃(Juglans regia)的根、莖、葉內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌為莖部最多，葉部次之，根部最少;竇學娥［18］進行桑樹內(nèi)生真菌分離，結(jié)果根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，莖部次之，葉部最少。馬尾松內(nèi)生真菌分離過程中，由于根和莖的橫切面會分泌較多油脂，阻礙了根和莖組織塊與PDA 培養(yǎng)基的接觸，接入培養(yǎng)基平板后，油脂在平板表面的散布也不利于內(nèi)生真菌的生長，所以根和莖部分離出的內(nèi)生真菌數(shù)量較少。其中根部分離的數(shù)量最少，這也可能是由于根系分泌物影響了根際微生物的生長。所分離的植物內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類還與取樣時間、植物種類、氣候條件、生長年限、分離方法、生長環(huán)境、取樣數(shù)量等因素有關(guān)。本研究的馬尾松樣品采自“國家級馬尾松重點林木良種基地”福建省漳平五一國有林場，分離到的內(nèi)生真菌具有典型性和代表性。如何解決馬尾松根、莖橫切面油脂分泌對內(nèi)生真菌分離的影響有待進一步探討。

不同器官內(nèi)生真菌的分布存在差異，可能是由于不同器官組織的結(jié)構(gòu)或者所含化學成分不同，所以入侵、生長的內(nèi)生真菌不同［19］。內(nèi)生真菌的侵染機理有待進一步研究，以更好地掌握內(nèi)生真菌種群分布多樣性的規(guī)律，豐富內(nèi)生真菌資源。

［1］ Petrini O． Fungal endophytes of tree leaves［M］Andrews J H，Hirano S S． Microbial ecology of leaves． New York:Springer Verlag，1991:179-197．

［2］ Ganley R J，Brunsfeld S J，Newcombe G． A community of unknown，endophytic fungi in western white pine［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(27):10107-10112．

［3］ Saikkonen K，W?li P，Helander M，et al． Evolution of endophyteplant symbioses［J］． Trends Plant Science，2004，9(6):275-280．

［4］ 謝安強，洪偉，吳承禎．桉樹內(nèi)生菌對尾巨桉幼苗抗寒生理指標的影響［J］．林業(yè)科學，2012，48(6):170-174．

［5］ 邢朝斌，龍月紅，李寶財，等．刺五加Cu/Zn SOD 的克隆及內(nèi)生真菌對其表達的影響［J］．東北林業(yè)大學學報，2013，41(1):82-85．

［6］ 鄧慧華，洪偉，吳承禎，等．馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株的分離、篩選和鑒定［J］．植物資源與環(huán)境學報，2014，23(2):27-33．

［7］ 鄧慧華，洪滔，吳承禎，等．馬尾松(Pinus massoniana)內(nèi)生真菌的產(chǎn)油脂效果［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2014，20(3):377-381．

［8］ 龔賀，張雷鳴，任偉超，等．膜莢黃芪內(nèi)生真菌的分離與鑒定［J］．東北林業(yè)大學學報，2014，42(3):141-143．

［9］ 李永，樸春根，賀偉，等．2 個歐美楊品種樹皮內(nèi)生真菌多樣性及優(yōu)勢種群動態(tài)變化［J］．林業(yè)科學，2013，49(6):90-96．

［10］ 陳婕，李會平，黃大莊．楊樹內(nèi)生真菌群落多樣性［J］．東北林業(yè)大學學報，2013，41(7):115-117，133．

［11］ 郭良棟．內(nèi)生真菌研究進展［J］．菌物系統(tǒng)，2001，20(1):148-152．

［12］ 周東坡，平文祥，孫建秋，等．紫杉醇產(chǎn)生菌分離的研究［J］．微生物學雜志，2001，21(1):18-19．

［13］ 邵力平．真菌分類學［M］．北京:中國林業(yè)出版社，1984．

［14］ 魏景超．真菌鑒定手冊［M］．上海:上海科學技術(shù)出版社，1979．

［15］ Carroll G． Fungal endophytes in stems and leaves:from latent pathogen to mutualistic symbiont［J］． Ecology，1988，69(1):2-9．

［16］ 宋萍，洪偉，吳承禎，等．雷公藤內(nèi)生真菌的分離及抗腫瘤活性研究［J］．北華大學學報:自然科學版，2009，10(4):310-313．

［17］ 高智輝，翟梅枝，王云果，等．核桃內(nèi)生真菌的分離鑒定［J］．西北林學院學報，2012，27(5):121-123．

［18］ 竇學娥．桑樹內(nèi)生真菌的分離鑒定及產(chǎn)油菌Macrophomina phaseolina MOD-1 的研究［D］．山東:山東農(nóng)業(yè)大學，2008．

［19］ 謝麗華，徐焰平，王國紅，等．茶樹品種、葉片生育期和茶葉化學成份對內(nèi)生真菌的影響［J］．菌物研究，2006，4(3):35-41．