張虹 任國領(lǐng) 徐晶雪 郎亞軍 丁海燕 黃永紅

(大慶師范學(xué)院，大慶，163712)

責(zé)任編輯:程 紅。

微生物采油技術(shù)(MEOR)作為大慶油田一項重要的接替技術(shù)，在大慶油田聚驅(qū)后油藏、低滲透油藏等油藏區(qū)塊進(jìn)行了多個現(xiàn)場礦場試驗應(yīng)用，試驗效果較理想［1－3］。微生物采油技術(shù)包括內(nèi)源微生物采油、外源微生物采油和直接注入微生物代謝產(chǎn)物以提高采油率等技術(shù)［4］，而外源微生物采油技術(shù)的關(guān)鍵是從油藏或者其它環(huán)境中分離和篩選性能優(yōu)良的微生物采油菌株。微生物采油技術(shù)提高原油采收率的機(jī)理主要包括:微生物對原油的乳化降解;微生物產(chǎn)生的表面活性劑、有機(jī)酸及生物氣等代謝產(chǎn)物影響原油的物理化學(xué)性質(zhì)，如降低原油黏度、減小油/巖及油/水接觸面的表面張力、改善原油的流動性等［5－6］。筆者從大慶油田低滲透油藏采出液中篩選得到以原油為唯一碳源的微生物菌株，命名為QSJU002，對篩選的菌株QSJU002 進(jìn)行生理生化特征和16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定，并根據(jù)測序得到的16S rDNA 基因序列進(jìn)行了熒光原位雜交(FISH)探針的設(shè)計。同時，從其降解原油、產(chǎn)表面活性劑、產(chǎn)酸、乳化原油和耐鹽等采油性能方面探討了將其應(yīng)用于MEOR 的可行性。

1 材料與方法

試驗樣品取自大慶油田低滲透油藏采油十廠采出液。

菌株的富集和篩選:取適量大慶油田低滲透油藏采出液于富集培養(yǎng)基(LB 培養(yǎng)基)中，放入37 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min－1恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，菌種富集培養(yǎng)。從中取5 mL 的上清液加到100 mL 以原油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h 后，將菌液制備梯度稀釋液(10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6倍)，逐一標(biāo)記，分別取100 μL 稀釋液加到選擇培養(yǎng)基固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d 至菌落出現(xiàn)。

菌株的純化:菌株的純化參考文獻(xiàn)［7］。挑取不同形態(tài)的單菌落三區(qū)劃線，進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微鏡觀察，重復(fù)劃線分離，直到確定其為單一菌株為止，純化菌株保存于LB 斜面培養(yǎng)基上，于冰箱中4℃保存。

菌株的生理生化特征鑒定:進(jìn)行淀粉水解、糖發(fā)酵、產(chǎn)氣、革蘭氏染色、V－P 試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠水解試驗，具體方法參見文獻(xiàn)［8］。

菌株的分子生物學(xué)鑒定參見文獻(xiàn)［9］－［11］。

菌株的采油性能評價:利用菌株對液體培養(yǎng)基石油的降解試驗、排油圈試驗、產(chǎn)酸試驗、乳化性能試驗和礦化度耐受性試驗進(jìn)行菌株降解原油、產(chǎn)表面活性劑、產(chǎn)酸、乳化原油和耐鹽等采油性能的評價。①降解試驗。將純菌株活化，以5%接種量接種于石油液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h 觀察培養(yǎng)液中石油狀態(tài)。②排油圈試驗。在培養(yǎng)皿中加入約10 mL蒸餾水，在蒸餾水中心加入2 mL 液體石蠟，為便于觀察，滴入染色液美藍(lán)，等液體石蠟擴(kuò)散成油膜時，在油膜中心加人2 mL 離心的發(fā)酵液，測定排油圈的的直徑。據(jù)張凡等［12］報道，排油圈的直徑和表面活性劑的量成正比。③產(chǎn)酸試驗。采用酚酞滴定法進(jìn)行菌株產(chǎn)酸能力測定，取菌株發(fā)酵液50 mL，以酚酞為指示劑，用0.1 mol·L－1NaOH 進(jìn)行滴定，并留未接菌的發(fā)酵液作為對照。

菌株乳化性能測定:取菌株48 h 培養(yǎng)液，5 mL于8 000 r·min－1離心20 min，取上清液，加入等量二甲苯，漩渦震蕩5 min 后，分別放置24、48、72 h 觀察乳化效果。

菌株礦化度耐受性測定:將斜面保藏菌株接種于石油培養(yǎng)基中活化48 h，以5%接種量接種于10% NaCl 濃度梯度培養(yǎng)液中，分別培養(yǎng)24、48 h，用分光光度計測定菌株生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與純化

從大慶油田低滲透油藏采出液中經(jīng)過富集、篩選和純化等步驟得到1 株以原油為唯一碳源的微生物菌株，命名為QSJU002。

2.2 菌株的生理生化特征

對分離的菌株QSJU002 進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化特征試驗。結(jié)果顯示，該菌株屬于革蘭氏陰性菌，糖酵解、淀粉水解、甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠水解試驗、牛奶石蕊試驗為陽性，產(chǎn)氣試驗、吲哚試驗為陰性。根據(jù)常用細(xì)菌鑒定方法，初步鑒定菌株QSJU002 為假單胞菌屬。

2.3 菌株的16S rDNA 序列分析

菌株16S rDNA 全序列(省略)拼接結(jié)果顯示:菌株QSJU002 16S rDNA 全長序列含有bp 核苷酸。將測得的序列與GenBank 中已報道的細(xì)菌菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果(表1)顯示，菌株QSJU002 16S rDNA 序列與最相近的前十個菌株的GenBank 相似性均為100%。

2.4 菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的創(chuàng)建

將QSJU002 16S rDNA 全長序列與BLAST 比對得到的前十個最相近菌株的16S rDNA 序列利用MEGA4 軟件進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。由圖1可見，QSJU002 與Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16(KM675945.1)堿基差別最小。由生理生化特征檢測、16S rDNA 鑒定結(jié)果可知，菌株QSJU002 與Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16 親緣關(guān)系最近，屬于假單胞菌屬。

表1 GeneBank 中與菌株QSJU002 親緣關(guān)系最近的前十個菌株

圖1 基于QSJU002 和親緣關(guān)系最近的前十個菌株的16S rDNA 構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株熒光原位雜交探針的設(shè)計

熒光原位雜交技術(shù)已在已知油藏微生物菌株的快速監(jiān)測中得到應(yīng)用［13］。熒光原位雜交探針的制備是熒光原位雜交的關(guān)鍵一步［14］，菌株的16S rDNA 序列的鑒定為探針的制備的基礎(chǔ)。根據(jù)寡核苷酸探針設(shè)計的基本原則［15］和QSJU002 菌株的16S rDNA 序列特征，設(shè)計了QSJU002 菌株的2 個熒光原位雜交探針:探針1，5'－GGTCTGAGAGGATGATCAGT－3';探針2，5'－GTCTGAGAGGATGATCAGT－3'。

2.6 菌株性能的評價

由表2所示，QSJU002 菌株在石油培養(yǎng)基中生長時，能夠使石油培養(yǎng)基出現(xiàn)顆粒均勻的小油滴，初步表明QSJU002 菌株具有降解原油的特征;QSJU002 菌株產(chǎn)生的排油圈直徑為5.6 cm，表明QSJU002 菌株具有產(chǎn)表面活性劑的功能;QSJU002菌株與空白對照組相比消耗NaOH 的量有所增加，表明QSJU002 菌株有一定的產(chǎn)酸能力;在10% NaCl濃度下QSJU002 菌株的生長狀況良好，表明QSJU002 菌株具有較好的礦化度耐受性。

表2 菌株QSJU002 采油性能評價

3 結(jié)論

通過富集培養(yǎng)、梯度稀釋涂布、平板三區(qū)劃線等技術(shù)，在大慶油田低滲透油藏采出液中分離純化得到1 株微生物菌株，命名為QSJU002，該菌株能夠在以原油為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基上生長。

結(jié)合生理生化特征檢測、16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定，菌株QSJU002 與Pseudomonas aeruginosa strain JBP－16 親緣關(guān)系最近，屬于假單胞菌屬。

根據(jù)寡核苷酸探針設(shè)計的基本原則和QSJU002菌株的16S rDNA 序列特征，設(shè)計了2 個QSJU002菌株的熒光原位雜交探針，分別是:探針1，5'－GGTCTGAGAGGATGATCAGT－3';探針2，5'－GTCTGAGAGGATGATCAGT－3'。

性能評價結(jié)果表明，菌株QSJU002 具有降解原油、產(chǎn)生物表面活性劑、產(chǎn)酸、乳化原油、耐鹽性等采油性能，具有較好的MEOR 應(yīng)用前景。

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