李德文 劉英 李美蘭 唐中華 于景華 祖元剛

(森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:王廣建。

隨著大氣平流層臭氧層變薄，到達地表的中波紫外線(UV－B，280～320 nm)量日漸增強，對地球生物產(chǎn)生嚴重影響［1］。國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于UV－B 輻射增強對植物生長發(fā)育和生理代謝影響等方面已作了大量的研究，但較多集中在農(nóng)作物、蔬果方面，對多年生的木本植物、藥用樹木研究的較少［2］。

一氧化氮(NO)是一種在動植物的多種生理活動中發(fā)揮作用的易擴散生物活性分子［3］，廣泛參與植物體內(nèi)多種生理代謝活動。低濃度的NO 可有效保護植物，高濃度NO 具有生理毒性，對植物具有一定的傷害［4］。NO 被認為是轉(zhuǎn)換UV－B 輻射信號的“積極分子”，因為在類似于一氧化氮合酶(NOS)的酶的作用下，NO 可以誘導(dǎo)查耳酮合酶(CHS)表達［5］。大量研究表明，添加外源NO 供體硝普鈉(SNP)可增強植物的抵抗能力與植物內(nèi)源NO 作用相同［6］。關(guān)于NO 對植物的抗性生理作用的研究處于初級階段，NO 對植物的氧化脅迫的調(diào)控機制，仍需進一步深入研究。

南方紅豆杉(Taxux chinensis var.mairei)為我國重要的抗癌植物，枝、葉、莖、皮、根、種子、果肉中均含有紫杉醇及其類似物，具有巨大的藥用開發(fā)利用價值［7］。楊逢建等［8］研究表明適當(dāng)增加環(huán)境UV－B輻射強度，可顯著提高南方紅豆杉體內(nèi)的紫杉醇質(zhì)量分數(shù)。本試驗選擇5年生人工種植的南方紅豆杉幼苗為材料，在增強UV－B 輻射強度下，研究外源NO 供體硝普鈉(SNP)對南方紅豆杉幼苗針葉光合色素、H2O2及紫杉醇等化合物質(zhì)量分數(shù)的影響，探討NO 對南方紅豆杉的生理代謝過程的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2012年6月3日—8月13日，在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)重點試驗室溫室內(nèi)進行。將5年生南方紅豆杉幼苗隨機分為4 組，每組60 株。試驗設(shè)置為對照(CK)處理、外源NO 供體硝普鈉(SNP)處理(0.1 mmol·L－1SNP)、UV－B 脅迫處理(4.22 kJ·m－2·d－1UV－B)、UV－B(4.22 kJ·m－2·d－1UV－B)+SNP(0.1 mmol·L－1SNP)處理。CK 為溫室內(nèi)自然光照處理，UV－B 處理為在溫室內(nèi)自然光照基礎(chǔ)上，人工添加4.22 kJ·m－2·d－1UV－B 輻射強度。人工增加UV－B 輻射是由UV－B 燈管(40 W，北京電光源研究所)產(chǎn)生，用0.08 mm 醋酸纖維膜過濾以消除UV－C(波長200～280 nm)的影響。每天UV－B 輻射處理周期為12 h(6:00—18:00)。UV－B 輻射強度用光譜儀AvaSpec 2048－2(Avantes BV，Netherlands)測定。SNP 購自上海國藥集團公司。處理9 d 后，選取已完全展開的、生長狀況、葉齡及葉位一致的南方紅豆杉針葉，測定各項生理指標(biāo)，每個處理均隨機取樣，9 次重復(fù)。

1.2 指標(biāo)測定方法

光合色素質(zhì)量分數(shù)測定參照高俊鳳［9］的方法;過氧化氫(H2O2)質(zhì)量分數(shù)參照魏曉雪等［2］的方法測定;稱取1 g 南方紅豆杉針葉，采用DMSO 分子探針法測定其羥基自由基(·OH)質(zhì)量分數(shù)［10］;黃酮和單寧質(zhì)量分數(shù)測定參照李蘭芳等［11］的方法;總酚測定參照程春龍［12］的方法;紫杉醇質(zhì)量分數(shù)測定參照祖元剛等［13］的方法，取0.5 g 南方紅豆杉針葉烘干粉末于10 mL 離心管中，加入甲醇10 mL，震蕩混勻后，超聲20 min，8 000 r·min－1離心20 min，提取上清液，重復(fù)2 次，合并上清液，濃縮至干，然后，用1 mL 色譜級甲醇復(fù)溶，用高效液相色譜法(HPLC)檢測;流動相為V(乙腈)∶V(水)=37 ∶63;Curosil－PFP 色譜柱(位置異構(gòu)體分析專用液相色譜柱;5 μm，4.6 mm×250 mm);以1 mL·min－1流速，進樣量10 μL，在234 nm 波長下檢測，柱溫為35 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個生理指標(biāo)重復(fù)9 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS16.0 軟件對各指標(biāo)不同處理間的差異顯著性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合色素質(zhì)量分數(shù)變化

處理9 天后，分別測定不同處理下南方紅豆杉幼苗針葉光合色素質(zhì)量分數(shù)(見表1)。由表1可知，與CK 相比，SNP 處理顯著增加了南方紅豆杉幼苗針葉葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素的質(zhì)量分數(shù);而UV－B 處理顯著降低了南方紅豆杉幼苗針葉葉綠素a、總?cè)~綠素的質(zhì)量分數(shù)及葉綠素a/b 的比值。與CK 相比，SNP、UV－B、UV－B+SNP 處理均顯著增加了南方紅豆杉幼苗針葉類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)。與UV－B 處理相比，UV－B+SNP 處理顯著增加了葉綠素a、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)及葉綠素a/b 的比值(p＜0.05)。

表1 外源NO 對UV－B 脅迫下南方紅豆杉幼苗針葉光合色素質(zhì)量分數(shù)的影響 mg·g－1

2.2 H2O2 質(zhì)量分數(shù)及·OH 水平的變化

如表2所示，不同處理對南方紅豆杉幼苗針葉中的H2O2質(zhì)量分數(shù)和·OH 水平的影響不同，與CK 相比，UV－B 處理顯著增加南方紅豆杉幼苗針葉H2O2質(zhì)量分數(shù)及·OH 水平(p ＜0.05)，分別提高11.3%(H2O2)和100%(·OH)。施加NO 供體對針葉內(nèi)·OH 水平無顯著影響(p＞0.05)。與CK 相比，SNP 處理顯著降低了南方紅豆杉幼苗針葉H2O2質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)。在UV－B 脅迫下，噴施0.1 mmol·L－1SNP 顯著降低了針葉的H2O2質(zhì)量分數(shù)和·OH的水平(p＜0.05)。

表2 外源NO 對UV－B 脅迫下南方紅豆杉幼苗針葉H2O2質(zhì)量分數(shù)和·OH 的影響

2.3 UV-B 吸收化合物及紫杉醇質(zhì)量分數(shù)變化

由表3可知，增強環(huán)境UV－B 輻射強度及噴施SNP 溶液均顯著提高南方紅豆杉幼苗針葉紫杉醇質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)，但二者復(fù)合作用與SNP 單獨處理下針葉紫杉醇質(zhì)量分數(shù)差異不明顯(p＞0.05)。不同處理下南方紅豆杉針葉紫杉醇質(zhì)量分數(shù)由小到大的順序為:CK、UV－B、SNP、UV－B+SNP。與CK 相比，SNP、UV－B、UV－B+SNP 處理均顯著增加了南方紅豆杉幼苗針葉類黃酮質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)，黃酮質(zhì)量分數(shù)由小到大的順序為:CK、SNP、UV－B、UV－B+SNP。UV－B、UV－B+SNP 處理下針葉內(nèi)總酚質(zhì)量分數(shù)顯著高于CK 及SNP 處理，可見UV－B 輻射對總酚質(zhì)量分數(shù)的影響大于SNP。與CK 相比，SNP、UVB、UV－B+SNP 處理均顯著增加了南方紅豆杉幼苗針葉單寧質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)。在UV－B 脅迫下，添加SNP 可有效增加黃酮、單寧及紫杉醇質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)，增強植物對UV－B 脅迫的抵抗能力。

表3 外源NO 對UV－B 脅迫下南方紅豆杉幼苗針葉紫杉醇和UV－B 吸收化合物質(zhì)量分數(shù)的影響 mg·g－1

3 結(jié)論與討論

光合色素質(zhì)量分數(shù)的變化直接影響植物對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，葉綠素a/b 可反映類囊體的垛疊程度，類囊體的垛疊程度越高，植株抵御逆境脅迫的能力就越強［14］。UV－B 處理降低了南方紅豆杉幼苗光合色素的質(zhì)量分數(shù)，這可能是因為在UV－B脅迫下，葉綠體膜結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠體基粒受到損傷，導(dǎo)致葉綠素加速分解或增加了葉綠素合成阻力，此外，由于葉綠素多以與蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式存在，UV－B 輻射增強可誘導(dǎo)蛋白變性，最終降低葉綠素質(zhì)量分數(shù)。試驗證實了葉綠素a 對UV－B 輻射更敏感這一理論。添加外源SNP 可顯著增加UV－B 輻射下南方紅豆杉針葉葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素的質(zhì)量分數(shù)。與此類似，劉建新等［15］研究表明在PEG6000 滲透脅迫下，施用SNP 顯著提高了黑麥草幼苗葉片光合色素質(zhì)量分數(shù)和類囊體的垛疊程度，而添加血紅蛋白后，SNP 的作用被消除，究其原因可能與NO 能夠促進植物葉綠體的發(fā)育有關(guān)。類胡蘿卜素是光系統(tǒng)的重要組成部分，是非常重要的結(jié)合于生物膜上的抗氧化劑［16］，可吸收過多的光能，避免葉綠素被氧化分解，降低UV－B 輻射對植物造成的氧化損傷［17］。研究發(fā)現(xiàn)提高環(huán)境UV－B 輻射強度及噴施低濃度SNP 均顯著提高針葉類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)，進一步證實植物可以通過提高類胡蘿卜素等抗氧化劑質(zhì)量分數(shù)以應(yīng)對非生物環(huán)境脅迫。

活性氧(ROS)水平提高可誘發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致細胞膜的完整性遭到破壞［18］。試驗中，UV－B 輻射增強，誘導(dǎo)了南方紅豆杉幼苗針葉中H2O2和·OH 的大量產(chǎn)生，噴施0.1 mmol·L－1SNP可顯著降低UV－B 脅迫下紅豆杉幼苗針葉中活性氧自由基(O2－·)質(zhì)量分數(shù)，降低膜質(zhì)過氧化程度。與此類似，在NaCl 脅迫下，外源NO 可顯著降低番茄幼苗葉片MDA(丙二醛)質(zhì)量分數(shù)和O2－·產(chǎn)生速率，能夠緩和膜相變化和膜透性的增大，阻止離子滲漏，具有良好的修復(fù)和保護細胞膜，維持細胞膜完整性的作用［18］。由于外源NO 供體可顯著提高南方紅豆杉針葉中H2O2清除劑(過氧化氫酶和過氧化物酶)的活性［19］，因此，SNP 導(dǎo)致活性氧自由基及MDA 質(zhì)量分數(shù)降低的一個可能機制是NO 可以促進植物體內(nèi)一系列抗氧化酶類基因的表達。

UV－B 輻射增強可誘導(dǎo)南方紅豆杉幼苗針葉紫杉醇質(zhì)量分數(shù)的升高，其原因可能是UV－B 輻射調(diào)控了代謝過程中某些參與合成紫杉醇的酶的活性，加速了紫杉醇的合成效率，從而增加了紫杉醇質(zhì)量分數(shù)，使紫杉醇質(zhì)量分數(shù)達到一種新的平衡以應(yīng)對UV－B 脅迫［20］。徐茂軍等［21］研究發(fā)現(xiàn)，添加外源SNP 處理可誘發(fā)紅豆杉等植物細胞合成次生代謝產(chǎn)物，推測NO 是增加植物細胞次生代謝產(chǎn)物合成的充分條件。試驗結(jié)果表明添加外源SNP 顯著增加了南方紅豆杉幼苗針葉的紫杉醇質(zhì)量分數(shù)，此外，在UV－B 脅迫下，添加外源0.1 mmol·L－1SNP 可顯著增加南方紅豆杉幼苗針葉的紫杉醇質(zhì)量分數(shù)。因此，NO 作為信號分子參與了紫杉醇合成的調(diào)控作用，該作用可能與NO 活化植物細胞防御反應(yīng)的功能有關(guān)［22－23］，但關(guān)于施加外源NO 供體誘導(dǎo)紫杉醇質(zhì)量分數(shù)增加的機制問題還需在分子水平上進一步的研究。

在植物體內(nèi)，黃酮作為清除UV－B 輻射誘發(fā)的活性氧的“淬滅劑”和濾除UV－B 輻射的“過濾劑”，其質(zhì)量分數(shù)的增加，被認為是植物響應(yīng)環(huán)境UV－B輻射增強的普遍特征之一［24］?？偡幽苡行誙V－B輻射，提高植物對UV－B 輻射的抵抗能力。單寧被認為是植物體內(nèi)普遍存在的次生代謝物質(zhì)和防御物質(zhì)［25］。與祖元剛等［13］的研究結(jié)果一致。研究證實UV－B 輻射增強，可誘導(dǎo)黃酮、總酚、單寧等質(zhì)量分數(shù)顯著增加，從而增強南方紅豆杉幼苗對UV－B 脅迫的抵抗能力。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在提高環(huán)境UV－B輻射下，噴施SNP 可以顯著增加南方紅豆杉針葉黃酮、單寧、總酚及紫杉醇質(zhì)量分數(shù)(p＜0.05)。徐茂軍等［22］試驗結(jié)果表明，添加0.5 mmol NO 淬滅劑(cPTIO)預(yù)處理可以完全抑制UV－B 對樺樹葉中NO水平的促進作用，并且抑制UV－B 處理下樺樹葉中黃酮的合成積累，并認為cPTIO 本身對樺樹幼葉中黃酮合成積累無抑制作用。外源NO 供體對植物細胞次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)的影響呈明顯的劑量效應(yīng)［26］，例如，施用高劑量的外源NO 供體SNP 可刺激苦參細胞中苦參堿的合成積累，而低劑量的外源NO 體SNP卻對次生代謝產(chǎn)物的合成積累無影響［27］。

綜上所述，提高環(huán)境UV－B 輻射強度可顯著增加南方紅豆杉針葉內(nèi)紫杉醇等重要次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分數(shù)，但UV－B 輻射脅迫處理會降低針葉光合色素質(zhì)量分數(shù)，影響植物生長，從而無法達到提高紫杉醇產(chǎn)量的目的。在UV－B 脅迫處理下，噴施低濃度外源NO 供體SNP 可提高南方紅豆杉次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)，并明顯降低針葉內(nèi)H2O2質(zhì)量分數(shù)和·OH 的水平，提高光合色素質(zhì)量分數(shù)，緩解UV－B 脅迫所導(dǎo)致的氧化損傷，進而提高紫杉醇產(chǎn)量。因此，通過合理提高環(huán)境UV－B 輻射強度并噴施外源NO供體以調(diào)節(jié)植物生長，促進紫杉醇等次生代謝產(chǎn)物合成，對于有效提高南方紅豆杉的經(jīng)濟價值具重要實踐意義。

［1］ 周秀驥，羅超，李維亮，等.中國地區(qū)臭氧總量變化與青藏高原低值中心［J］.科學(xué)通報，1995，40(15):1396－1398.

［2］ 魏曉雪，于景華，李德文，等.UV－B 輻射增強對紅松幼苗針葉脂質(zhì)過氧化及抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2011，47(5):54－59.

［3］ Durner J，Klessig D F.Nitric oxide as a signal in plants［J］.Current Opinion in Plant Biology，1999，2(5):369－374.

［4］ Siddiqui M H，Whaibi M H A，Basalah M O.Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress［J］.Protoplasma，2011，248(3):447－455.

［5］ Mackerness S A H，John C F，Jordan B，et al.Early signaling components in ultraviolet-B responses:distinct roles for different reactive oxygen species and nitric oxide［J］.FEBS Lett，2001，489(2/3):237－242.

［6］ 袁芳，楊劍超，陳敏，等.NaCl 脅迫下外源NO 供體硝普鈉(SNP)對鹽地堿蓬種子萌發(fā)的影響［J］.植物生理學(xué)通訊，2010，46(1):24－28.

［7］ 張蕊，周志春，金國慶，等.南方紅豆杉種源遺傳多樣性和遺傳分化［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45(1):50－56.

［8］ 楊逢建，龐海河，張學(xué)科，等.光脅迫對南方紅豆杉葉片中葉綠體色素和紫杉醇質(zhì)量分數(shù)的影響［J］.植物研究，2007，27(5):556－558.

［9］ 高俊鳳.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京:高等教育出版社，2006.

［10］ Bhaduri P N，Ghosh M.Excised embryo culturing:the study of inheritance of root types in rice［J］.Botanical Magazine，1965，78:348－352.

［11］ 李蘭芳，張魁，吳樹勛，等.不同生長期白羊草中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)測定［J］.中國野生植物資源，1996，23(4):37－39.

［12］ 程春龍.額濟納綠洲胡楊體內(nèi)酚類物質(zhì)分布及其對環(huán)境變化的響應(yīng)研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2007.

［13］ Zu Y G，Pang H H，Yu J H，et al.Responses in the morphology，physiology and biochemistry of Taxus chinensis var.mairei grown under supplementary UV－B radiation［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology，2010，98(2):152－158.

［14］ 敬巖，孫寶騰，符建榮.一氧化氮改善鐵脅迫玉米光合組織結(jié)構(gòu)及其活性［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2007，13(5):809－815.

［15］ 劉建新，王金成，王瑞娟，等.外源一氧化氮對滲透脅迫下黑麥草幼苗光合和生物發(fā)光特性的影響［J］.草業(yè)學(xué)報，2013，22(1):210－216.

［16］ Tracewell C A，Vrettos J S，Bautista J A.Carotenoid photooxidation in photosystemⅡ［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，385(1):61－69.

［17］ Quaite F E，Sutherland B M，Sutherland J C.Action spectrum for DNA damage in alfalfa lowers predicted impact of ozone depletion［J］.Nature，1992，358:576－578.

［18］ 吳雪霞，朱月林，朱為民，等.外源一氧化氮對NaCl 脅迫下番茄幼苗生理影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(3):575－581.

［19］ 李德文，李美蘭，于景華，等.外源NO 對UV－B 脅迫下紅豆杉抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2012，31(9):2203－2208.

［20］ 龐海河.增強UV－B 輻射下南方紅豆杉形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝的研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2010.

［21］ Xu M J，Jin H H，Dong J F，et al.Abscisic acid plays critical role in ozone-induced taxol production of Taxus chinensis suspension cell cultures［J］.Biotechnology Progress，2011，27(5):1415－1420.

［22］ 徐茂軍，董菊芳，朱睦元.NO 可以通過水楊酸(SA)或者茉莉酸(JA)信號途徑介導(dǎo)真菌誘導(dǎo)子對粉葛懸浮細胞中葛根素生物合成的促進作用［J］.中國科學(xué):C 輯:生命科學(xué)，2006，36(1):66 －75.

［23］ 郝鶴，葉和春，王紅.一氧化氮對新疆紫草愈傷組織中紫草素及其衍生物合成的影響［J］.中國科學(xué)院大學(xué)學(xué)報，2014，31(1):46－53.

［24］ Appel H M.Phenolics in ecological interactions:The importance of oxidation［J］.Journal of Chemical Ecology，1993，19(7):1521－1552.

［25］ Lavola A.Accumulation of flavonoids and related compounds in birch induced by UV－B irradiance［J］.Tree Physiology，1998，18(1):53－58.

［26］ 李美蘭，李德文，于景華，等.外源NO 對南方紅豆杉幼苗光合色素及抗氧化酶的影響［J］.植物研究，2013，33(1):39－44.

［27］ Xu M J，Dong J E.Synergistic action between jasmonic acid and nitric oxide in inducing matrine accumulation of Sophora flavescens suspension cells［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(1):92－101.