朱虹 郭曉瑞

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

責(zé)任編輯:任 俐。

鹽脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制性因素，鹽脅迫通過改變水勢和離子分配來擾亂植物體激素水平，從而阻止植物的生長，并且產(chǎn)生氧化脅迫。鹽脅迫對植物的傷害程度取決于脅迫程度、生長環(huán)境和植物對鹽的敏感程度。對于鹽土植物，鹽脅迫會使無機離子聚集，主要是鈉離子和氯離子儲存在液泡中。氮肥不僅可以促進植物的生長還可以降低鹽脅迫對植物的傷害［1］，而氮素的形態(tài)可以改變植物的生長、產(chǎn)量和植物組織中的化學(xué)成分［2-4］。宏觀上，增施氮肥，主要是增大了葉面積，有利于后期干物質(zhì)的積累和作物氮素同化，促進了蛋白質(zhì)和其他含氮化合物的合成，增強了作物的持水力，緩解了土壤水分脅迫對作物造成的不良影響［5-6］。氮素是葉綠素的主要成分，施氮一般能促進植物葉片葉綠素的合成。有文獻(xiàn)報道，用NH+4和NO-3混合氮源與只有硝酸作為氮源的大麥相比［7］，前者可以大大增加作物的生物量產(chǎn)量，從而減少了鹽脅迫的作用。

長春花繁殖能力強，全年開花結(jié)果，種子數(shù)量較多，生活周期較短，生境類型較多，同時不同氮素生境下的長春花植株在生活史過程中表現(xiàn)出較強的可塑性，因而，其是研究植物生理生態(tài)學(xué)較好的材料之一，對長春花不同氮素形態(tài)和鹽脅迫條件下的研究為具有相似生活史過程的其他物種的研究提供了參考資料，同時作為一種熱帶和亞熱帶植物，從地理帶劃分上也豐富了生理生態(tài)學(xué)理論。同時，有關(guān)長春花體內(nèi)對人類有利用價值的藥用成分，諸如長春堿等生物堿在長春花完成其整個生活史的過程中的生態(tài)學(xué)意義的深入研究對于栽培、保護利用長春花有很重要的意義。把氮素和鹽脅迫條件下生長指標(biāo)的理論應(yīng)用到長春花的生產(chǎn)實踐中去，對于更好地開發(fā)利用和保護長春花更有不可估量的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義，為長春花下一步的全國大面積的推廣栽培及工業(yè)化、生態(tài)化經(jīng)營和以后長春堿、長春新堿等生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和重要依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2008年6—8月份在森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))溫室內(nèi)進行。材料為正常沙壤土中生長一致的長春花幼苗，待其長出第三對葉片后，洗凈根部沙土，移栽到珍珠巖中培養(yǎng)。設(shè)置氮源形態(tài)分別為:100% NO-3(無鹽)、100%NO-3+200 mmol·L-1NaCl、50% NO-3+50% NH+4(無鹽)、50% NO-3+50% NH+4+200 mmol·L-1NaCl、25%NO-3+75% NH+4(無鹽)、25% NO-3+75% NH+4+200 mmol·L-1NaCl、100%谷氨酰胺(無鹽)、100%谷氨酰胺+200 mmol·L-1NaCl。

硝酸還原酶(NR)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)等氮代謝酶活性的測定:硝酸還原酶的活性測定參照α-萘胺法［8］。分別將長春花的根和葉片在液氮條件下研碎，精確稱取0.2 g，加入磷酸緩沖提取液1 mL(25 mmol·L-1磷酸緩沖液加1 mmol·L-1EDTA 和10 mmol·L-1半胱氨酸，pH 值8.8)，4 ℃下離心(18 000 r·min-1，15 min)后提取上清液為待測酶液。吸取0.5 mL KNO3溶液、0.3 mL NADH 和0.2 mL 酶液，混合后在25 ℃下保溫30 min。保溫結(jié)束后，立即加入0.5 mL 1%氨基苯磺酰胺和0.5 mL 萘基乙烯二胺水溶液，靜置15 min 以上，用酶標(biāo)儀在492 nm 處測定光吸收，以不加NADH 的(加入0.3 mL 水)作為空白對照。樣品的光吸收減去空白對照的光吸收等于光吸收的增量，即為1 mL 反應(yīng)液中在保溫30 min 內(nèi)，由于酶的作用而增加的NO-2 數(shù)量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算該光吸收的增量相當(dāng)于多少微克的NO-2。

谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶活性(GDH)測定參照Lu et al.［9］的方法。測定GS 活性用100 mmol·L-1、pH 值7.6 的Tris-HCI 緩沖液提取酶。酶活性反應(yīng)液組成為0.6 mL 咪唑鹽酸緩沖液、0.4 mL 谷氨酸鈉溶液、0.4 mL ATP2Na 溶液(30 mmol·L-1，pH 值7.0)、MgSO4溶液(0.5 mol·L-1)、酶提取液1.2 mL。反應(yīng)液0.2 mL 在25 ℃水浴中保溫5 min，加入0.2 mL 羥胺試劑開始反應(yīng)，在25 ℃水浴中反應(yīng)15 min，加入0.8 mL 反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，酶活性反應(yīng)液在4 000 r·min-1條件下離心15 min，用紫外分光光度計在540 nm 處測定上清液的光密度。一個GS 活性單位定義為該反應(yīng)條件下，在15 min 反應(yīng)時間內(nèi)催化形成1 μmol γ-谷氨酰異羥肟酸需要的酶量，總活性為每克鮮樣酶粗液在15 min 的反應(yīng)時間內(nèi)催化形成γ-谷氨酰異羥肟酸的微摩爾數(shù)。在NADH-GDH 活性反應(yīng)系統(tǒng)中，每分鐘光吸收0.001 的變化，為酶的活性單位。

游離氨基酸的檢測方法:采用AccQ·Tag 方法測定。儀器和試劑為Waters Alliance 色譜系統(tǒng)，1525-717 系統(tǒng)，2487 紫外檢測器，Millennium 色譜管理系統(tǒng);反相C18柱(3.9 mm×150 mm)。AccQ·Tag流動相A 濃液，AccQ·Flour 衍生劑和2.5 mmol·L-117AA 標(biāo)準(zhǔn)溶液(Waters 公司)，超純水。色譜條件，流動相:A 液(Waters 公司)，V(A 液)∶V(超純水)=1 ∶10，B 液為V(乙腈)∶V(水)= 60 ∶40;流速為1.0 mL·min-1，柱溫為37 ℃，檢測波長為248 nm，進樣量為10 μL。

形態(tài)學(xué)參數(shù)的設(shè)定及取樣方法:采用表型相關(guān)法，即通過選擇與植物生長和發(fā)育相關(guān)的一些參數(shù)，如株高、基莖、節(jié)間長、生物量等，運用統(tǒng)計學(xué)方法對這些數(shù)據(jù)之間及與生境參數(shù)之間進行相關(guān)性分析，從而反映植物生長及受生境的影響情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源不同形態(tài)氮素條件下長春花抗鹽脅迫的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

在有鹽和無鹽條件下，外施不同氮源對長春花的生長影響顯著(表1)。當(dāng)谷氨酸和50% NO-3+50%NH+4作為氮源時，發(fā)現(xiàn)無鹽和加鹽處理的長春花幼苗株高發(fā)生顯著變化。在鹽脅迫條件下，外施谷氨酸，長春花株高降低，說明鹽脅迫使長春花株高降低。但是，在鹽脅迫條件下，外施各種氮源，都促進基莖增大;硝酸鹽、谷氨酰胺分別單獨作為氮源時，基莖增加較顯著。

觀察鹽脅迫條件下，外施不同氮源對長春花幼苗葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響表明，鹽脅迫條件下，外施不同氮源，顯著促進了長春花幼苗葉片鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的增加，說明外施不同氮源可以提高長春花抵抗適量鹽脅迫的能力。

表1 不同氮素形態(tài)條件下長春花抵抗鹽脅迫表型性狀的變化

2.2 外源不同形態(tài)氮素條件下長春花抵抗鹽脅迫體內(nèi)初級氮代謝酶的變化

在不同形態(tài)氮素條件下，硝酸還原酶(NR)變化顯著(表2)。在硝酸單獨作為氮源和50%NO-3+50%NH+4作為氮源時，加鹽處理的NR 水平要顯著高于無鹽處理的。但加鹽處理時，同時加其他兩種氮源(25%NO-3+75%NH+4和谷氨酰胺)處理時，NR水平要顯著低于無鹽處理?？梢钥闯觯?dāng)硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞50%，加鹽處理時的NR 活性顯著提高。

當(dāng)硝酸鹽和谷氨酸為氮源時，GS(谷氨酰胺合成酶)活性的加鹽處理水平要顯著高于無鹽處理的，當(dāng)50% NO-3+50% NH+4和25% NO-3+75% NH+4為氮源時，在無鹽處理時，GS 活性要顯著高于加鹽處理的。

GDH(谷氨酸脫氫酶)活性除在以25% NO-3+75% NH+4為氮源之外，其他3 種氮源處理時，加鹽處理的GDH 活性均顯著高于無鹽處理的，并且4 種氮源條件下加鹽處理的GDH 活性相似，隨著氨離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，無鹽處理的GDH 活性水平也顯著增加。

表2 長春花幼苗在不同形態(tài)氮素條件下抵抗鹽脅迫葉片中NR、GS 和GDH 活性變化

2.3 外源不同形態(tài)氮素條件下長春花抵抗鹽脅迫體內(nèi)游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

氨基酸是植物體內(nèi)重要的代謝物質(zhì)，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的成分，而蛋白質(zhì)又是基因的產(chǎn)物和表達(dá)形式，所以，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化在很大程度上反應(yīng)了植物體內(nèi)氨基酸代謝的變化，反應(yīng)了遺傳上的變異性［9-11］。有許多研究表明，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與鹽脅迫存在一定的相關(guān)關(guān)系。由表2可知，游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在硝酸鹽單獨作為氮源時，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)無鹽處理的顯著高于加鹽處理的;25% NO-3+75% NH+4作為氮源時，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)加鹽處理的顯著低于無鹽處理;50% NO-3+50% NH+4和谷氨酰胺分別為氮源時，無鹽處理的氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他氮源的，但鹽脅迫抵制了氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)論與討論

鹽脅迫是植物生長的主要限制性因素，植物受傷害的大小要依賴于鹽脅迫程度、生長條件和植物對鹽的敏感性。不同氮源條件下長春花的生長在無鹽和加鹽處理時受到很大影響。有文獻(xiàn)報道［12］，用NH+4和NO-3混合氮源與只有硝態(tài)氮作為氮源的大麥相比，前者可以大大增加作物的生物量，并且證明這種增高與單位面積上的光合作用沒有聯(lián)系，而主要是通過增加了光合作用在整個葉面積上的利用率。這種低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NH+4對生長的刺激作用與能量的節(jié)省有關(guān)，代謝NO-3對能量的需求是20 分子的ATP/NO-3，而NH+4只需要5 分子的ATP，當(dāng)?shù)诟写x時，氨將節(jié)省8%～12%的能量，在莖中節(jié)省3%～6%［1］;另一個原因可能是，當(dāng)只用NH+4作為氮源時，ABA 合成的醛氧化酶活性以及ABA含量均有顯著增加。但當(dāng)外源氨態(tài)氮濃度過大，超過根系的代謝吸收能力時，就會使根溶液酸化［3］。另外，外源氨態(tài)氮能促進谷氨酰胺、脯氨酸以及其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和積累，從而提高植物的耐鹽性［7］。胡潤芳等［14］報道，氨態(tài)氮增加3 個大豆品種功能葉片NR(硝酸還原酶)活性效果最好，3 個大豆品種的植物中GS(谷氨酰胺合成酶)活性增加［13］。本試驗證明了與硝酸作為氮源相比，無論是鹽脅迫還是正常生長的大麥氨態(tài)氮源都可以使GS 活性增加。另一方面，GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)活性沒有明顯的改變。由此推測，這可能會導(dǎo)致谷氨酰胺源的增加，也會導(dǎo)致對氮同化的消極反饋。在響應(yīng)外源不同氮素的過程中，對GDH(谷氨酸脫氫酶)的功能目前還不是很清楚。盡管基因表達(dá)和酶的活性試驗結(jié)果都表明，GDH 在植物體內(nèi)的主要功能是參與谷氨酸的分解代謝，但Magalh?es et al.［15］發(fā)現(xiàn)，缺失GDH 的玉米突變體植株不能吸收利用外源氨態(tài)氮，而與之對照的野生型植株就可以吸收利用氨態(tài)氮。Lasa et al.［16］的研究也認(rèn)為，GDH 對于大豆吸收利用氨態(tài)氮具有重要作用。這些試驗結(jié)果都說明在植物體內(nèi)，GDH 可以催化氨的合成反應(yīng)。尤其是在高氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，植物中的GDH 的活性因為受到誘導(dǎo)而增加，以同化氨而盡可能降低氨的毒害［17］。另外，據(jù)Ota et al.［17］報道，在全氨營養(yǎng)時，蘿卜植株葉片中游離氨基酸以谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸和脯氨酸為主;而全硝營養(yǎng)時主要組分為天冬氨酸和谷氨酸，且游離氨基酸的總量低于全氨營養(yǎng)。Lasa et al.［16］的研究也表明，全氨營養(yǎng)時菠菜莖葉中游離氨基酸以谷氨酰胺和精氨酸為主;在全硝營養(yǎng)時，以谷氨酸和天冬氨酸為主。

在生理學(xué)方面，適量的氨態(tài)氮和谷氨酸氮源可以促進長春花游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的積累。當(dāng)硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞50%時，加鹽處理的NR 活性就越高。GS 活性在單獨硝酸鹽和谷氨酰胺為氮源時加鹽處理水平分別顯著高于無鹽處理的。隨著氨離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，無鹽處理的GDH 水平也顯著增加。游離氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在硝酸鹽單獨作為氮源時，加鹽處理誘導(dǎo)其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)大部分顯著低于無鹽處理的［18-20］?？傊旌系纯梢詼p少鹽脅迫對長春花的傷害。這種作用可能和氮代謝過程中關(guān)鍵酶活性的增加有關(guān)，特別是和氨代謝有關(guān)的酶，適量的氨離子可以節(jié)省植物代謝硝態(tài)氮的能量［19］，但是過量的氮會使植物受到毒害作用;另外，有機氮如谷氨酰胺對長春花抵抗鹽脅迫也有一定的作用。

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