張帆，唐妮娜，劉慧琳，郭琳瑯(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州510282)

肺癌細(xì)胞株A549、H1650、DMS53中整合素α3的表達(dá)比較

張帆，唐妮娜，劉慧琳，郭琳瑯
(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州510282)

摘要:目的比較整合素α3( ITGA3)在三種肺癌細(xì)胞株A549(肺腺癌)、H1650(肺泡細(xì)胞癌)、DMS53(小細(xì)胞肺癌)中的表達(dá)。方法應(yīng)用基因芯片技術(shù)提取A549、H1650、DMS53細(xì)胞株的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以32P標(biāo)記cDNA，與整合素基因芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影后讀取灰度值，并以基因表達(dá)的限制性分析( RAGE)和流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果ITGA3亞單位在A549、H1650、DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)分別為7.58±1.37、8.10± 1.51、2.38±0.20，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01。RAGE結(jié)果顯示，經(jīng)AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53細(xì)胞株均出現(xiàn)ITGA3( 69 bp)，分別為167.0、172.1、44.7，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，ITGA3在A549、H1650、DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)分別為83.62±1.40、90.86± 4.78、1.24±0.53，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01。結(jié)論ITGA3在A549和H1650細(xì)胞株中的表達(dá)上調(diào)，高于其在DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)。

關(guān)鍵詞:肺腫瘤;肺癌細(xì)胞;整合素α3

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一。隨著工業(yè)化的發(fā)展及空氣和環(huán)境污染的加劇，肺癌發(fā)病率逐漸增加，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，肺癌在全球的增長(zhǎng)速度為每年0.5%，初治病例約70%是晚期患者［1］。肺癌的惡性程度與腫瘤的類型、級(jí)別相關(guān)。瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的早晚是腫瘤惡性程度的標(biāo)志，而腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，參與腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控的相關(guān)基因多達(dá)數(shù)百種。DNA修復(fù)基因、抑癌基因、抗凋亡基因、整合素等的多態(tài)性與個(gè)體對(duì)肺癌細(xì)胞的易感性有關(guān)［2～5］，其中整合素在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和凋亡分子被發(fā)現(xiàn)，其中整合素在肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及凋亡各個(gè)步驟中所起的作用逐漸被認(rèn)識(shí)。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)、基因表達(dá)的限制性分析( RAGE)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較了三種不同類型的肺癌細(xì)胞株中整合素α3 ( ITGA3)的表達(dá)差異。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑本實(shí)驗(yàn)所用A549(肺腺癌)、H1650(肺泡細(xì)胞癌)、DMS53(小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞株購(gòu)自The American Type Culture Collection( ATCC) ;所用基因芯片為細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子分類芯片( SuperArray Inc.Bethesda，MD，USA) ;鼠抗人α3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司; FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)One Lambda公司; HexaLabelTMDNA Labeling Kit購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。

1.2三種肺癌細(xì)胞株中ITGA3檢測(cè)方法取凍存的A549、H1650、DMS53細(xì)胞株37℃融化后，1 000 r/min離心10 min，用含有10%胎牛血清( Hyclone公司)的低糖DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司)懸浮，移入培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)液中加入青鏈雙抗液，使終濃度為100 μg/mL，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次。提取三種細(xì)胞株中的總RNA，濃縮、純化，逆轉(zhuǎn)錄合成并以32P ( 10 Ci/L)標(biāo)記cDNA，與基因芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，可出現(xiàn)強(qiáng)弱不同的雜交點(diǎn)，以成像系統(tǒng)讀取數(shù)值，并以軟件ScanAlyze2和GEArrayAnalyzer分析。從基因庫(kù)獲取ITGA3亞單位的cDNA序列，采用MacVector公司ClustalW軟件設(shè)計(jì)引物序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將ITGA3亞單位的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用分子圖像FX成像器掃描凝膠，并用Bio-Rad軟件分析。將1×106的培養(yǎng)細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，50 mg/mL多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌破膜裂解細(xì)胞，用2 μg/mL的鼠抗人α3單克隆抗體孵育1 h，

800 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗2遍后，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，稀釋濃度為1∶50，孵育30 min。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的熒光水平。重復(fù)以上操作3次，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用one-way ANOVA，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

ITGA3亞單位在A549、H1650、DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)分別為7.58±1.37、8.10±1.51、2.38± 0.20，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細(xì)胞株比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

RAGE結(jié)果顯示，經(jīng)AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53細(xì)胞株均出現(xiàn)ITGA3( 69 bp)，分別為167.0、172.1、44.7，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細(xì)胞株比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，ITGA3在A549、H1650、DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)分別為83.62 ±1.40、90.86±4.78、1.24±0.53，A549、H1650與DMS53細(xì)胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細(xì)胞株比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3　討論

整合素是位于細(xì)胞表面的異二聚體，是連接細(xì)胞骨架及細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞表面受體，其胞內(nèi)部分(＜70個(gè)殘基)連接細(xì)胞內(nèi)骨架，較大的胞膜外區(qū)域(＞700個(gè)殘基)與配體結(jié)合，以建立細(xì)胞內(nèi)外的聯(lián)系［6］。整合素通過(guò)識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)中配體蛋白的特殊序列與配體結(jié)合，其中RGD序列是最經(jīng)典的識(shí)別序列?？拷黂GD多肽結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基決定了整合素-配體結(jié)合特異性及親和力［7］。目前確認(rèn)的18種α亞單位和8種β亞單位共同組成至少24種整合素［8］。整合素在正常組織和瘤組織中的表達(dá)是不同的，研究人類腫瘤細(xì)胞整合素表達(dá)與腫瘤類型、級(jí)別及病理結(jié)果的相關(guān)性，可識(shí)別整合素在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用。整合素不僅介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附反應(yīng)，還具有細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)功能［9，10］，整合素可通過(guò)傳遞特定的信號(hào)或誘導(dǎo)基因表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡［11，12］。整合素的過(guò)度表達(dá)、缺失或磷酸化影響細(xì)胞骨架與細(xì)胞外配體的特異結(jié)合，整合素表達(dá)的變化在腫瘤的發(fā)生或抑制過(guò)程中起重要作用。大量的研究表明，整合素在惡性腫瘤和同型的癌前病變之間的表達(dá)和分布有著顯著的差異。整合素表達(dá)上調(diào)并非總是與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，不同整合素對(duì)不同類型腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移作用不同。同一整合素在不同腫瘤中的作用也不盡相同。

本研究的整合素家族基因芯片分析結(jié)果顯示，ITGA3在A549和H1650細(xì)胞株中的表達(dá)高于其在DMS53細(xì)胞株中的表達(dá)。且這一結(jié)果在RAGE和流式細(xì)胞儀檢測(cè)中得到驗(yàn)證。ITGA3在肺組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，ITGA3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1650和A549的表達(dá)上調(diào)，ITGA3表達(dá)下調(diào)可使非小細(xì)胞肺癌中具有致瘤性的c-myc的表達(dá)增強(qiáng)，因而為腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件［13］，ITGA3表達(dá)下調(diào)同時(shí)也預(yù)示著肺腺癌患者的預(yù)后不良。ITGA3表達(dá)的降低與某些惡性腫瘤的發(fā)生或其他腫瘤的侵入密切相關(guān)［14］，在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS53中，ITGA3的表達(dá)下調(diào)，這為小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和早期轉(zhuǎn)移提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

總之，三種不同類型的肺癌細(xì)胞株中ITGA3表達(dá)存在差異，這種表達(dá)差異性一方面可作為鑒別小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物，同時(shí)還有望成為肺癌基因治療新的靶點(diǎn)。

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收稿日期:( 2015-05-11)

通信作者:郭琳瑯

基金項(xiàng)目:廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目( 2013B021500146)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)31-0025-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.009