種樹彬，蘭海梅，曾抗，趙學(xué)峰(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東佛山5800;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)

銀屑病患者病灶組織、血清中抗菌肽LL-37表達(dá)變化及意義

種樹彬1，蘭海梅2，曾抗2，趙學(xué)峰1
(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院，廣東佛山528200;2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)

摘要:目的探討銀屑病患者病灶組織與血清中抗菌肽LL-37表達(dá)變化及其意義。方法收集45例尋常型銀屑病患者(觀察組)和44例健康人群(健康對照組)的血清，另選取25例尋常型銀屑病患者的病灶組織(試驗組)和25例因創(chuàng)傷需自體手術(shù)植皮患者的正常皮膚組織(對照組)。血清LL-37水平檢測采用ELISA法。銀屑病病情嚴(yán)重程度采用PASI評分法判定，分析血清LL-37水平與銀屑病病情嚴(yán)重程度及炎癥因子IL-22和IFN-γ的相關(guān)性。采用Western blotting免疫印跡法和RT-PCR法檢測病灶組織中LL-37蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果觀察組與健康對照組血清LL-37水平分別為12.3、9.43 ng/mL，兩組比較，P＜0.01。觀察組PASI得分平均13.7分。觀察組與健康對照組血清LL-37水平與銀屑病病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r =0.515，P＜0.001)。試驗組LL-37mRNA表達(dá)約為對照組的5.1倍，LL-37蛋白表達(dá)約為對照組的5.3倍，兩組LL-37mRNA及蛋白表達(dá)比較，P均＜0.01。結(jié)論銀屑病患者病灶組織及血清中抗菌肽LL-37表達(dá)均顯著升高，檢測抗菌肽LL-37有助于評判銀屑病病情嚴(yán)重程度。

關(guān)鍵詞:銀屑病;抗菌肽LL-37; PASI指數(shù)

銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，易反復(fù)發(fā)作。皮損的主要病理學(xué)變化是角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤、血管異常增生［1］。其發(fā)病原因尚未完全明確，目前認(rèn)為免疫系統(tǒng)紊亂起到一定作用，而炎癥細(xì)胞功能改變是銀屑病的潛在病因［2］。研究［3］表明由炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的諸多炎癥因子在銀屑病發(fā)病和進(jìn)展中起重要作用。抗菌肽LL-37是Catheliecidin家族抗菌肽蛋白N端的37個氨基酸，因其開始的氨基酸分別為L-L而得名。最近研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞及抗菌肽LL-37在銀屑病的進(jìn)展中有重要作用?？咕腖L-37具有廣譜的抗微生物活性及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)損傷修復(fù)、抗腫瘤等功能［4］。2013年4月～2014年9月，我們觀察了銀屑病患者病灶組織、血清中LL-37表達(dá)變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料25例尋常型銀屑病進(jìn)展期患者［男12例、女13例，年齡(29.7±5.2)歲，BMI為(22.4±1.8)kg/m2］的病灶組織(試驗組)和25例［男11例、女14例，年齡(29.9±4.9)歲，BMI為(23.1±1.6)kg/m2］因創(chuàng)傷需自體手術(shù)植皮患者的正常皮膚組織(對照組)用于組織學(xué)研究，兩組年齡、性別、BMI具有可比性。均未接受口服藥物治療2周及外用藥物治療1周以上。排除標(biāo)準(zhǔn):哺乳期患者、其它自身免疫性疾病、惡性腫瘤、糖尿病、肝腎功能不全、濕疹等其他皮膚病除外。將兩組皮膚組織分別進(jìn)行組織切割，獲得真皮層及角質(zhì)層皮膚樣本，提取皮膚組織蛋白，立即置于RNAlater液低溫保存。獲取組織前患者均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。另選取進(jìn)展期銀屑病患者45例［男27例、女18例，年齡(31.8±7.4)歲，BMI(23.6 ±2.6)kg/m2］作為觀察組。入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)同上。健康對照組選擇同一時間查體健康者44例［男27例、女17例，年齡(30.9±8.1)歲，BMI(22.9 ±2.9)kg/m2］。空腹抽取兩組上肢靜脈血5mL，經(jīng)EDTA抗凝，－80℃冰箱存放待測。

1.2血清LL-37檢測分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔，采用ELISA法檢測血清LL-37。操作按人LL-37、IL-22和IFN-γ試劑盒說明進(jìn)行，每孔各加入稀釋PBS緩沖液稀釋1 000倍的待測血清10 μL，在37℃環(huán)境下溫育30min;洗板5次，加入酶標(biāo)試劑50 μL，混勻，37℃環(huán)境繼續(xù)溫育30min，洗板后加入顯色劑避光顯色10min。在450 nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.3病灶組織中LL-37蛋白檢測采用Western blotting法。將試驗組和對照組皮膚組織剪切成小

塊，加入適量的冰冷PBS均漿，靜置5min，棄沉淀，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中;按常規(guī)操作步驟提取蛋白，盡快將上清轉(zhuǎn)入一預(yù)冷的潔凈微量離心管，即得核蛋白;上述提取的胞漿蛋白和核蛋白進(jìn)行蛋白定量(Braford法或BCA法)，分裝并保存于－80℃，避免反復(fù)凍融。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉后分別與抗β-actin(1∶1 000)、抗LL-37(1∶500)進(jìn)行反應(yīng)。取相同體積的A、B試劑，在保鮮膜上將其充分混勻; 1min后，將膜蛋白面朝下放置，并與A、B混合液進(jìn)行接觸; 1min后移開膜并將其置于另一保鮮膜上，將膜上殘存的混合液去掉，再將其充分包好后放入X-光片夾中。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的相對分子質(zhì)量和凈光密度值。

1.4病灶組織中LL-37mRNA檢測總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄從樣本保存液中取出，根據(jù)RNA提取試劑盒上的操作步驟進(jìn)行。RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃、3 s，95℃、5 s，60℃、34 s，循環(huán)40次。每標(biāo)本檢測2次。根據(jù)最終的優(yōu)化體系，比較目的基因與內(nèi)標(biāo)基因擴增效率的斜率回歸有無顯著性差異。每次實驗均重復(fù)3次以上。

1.5血清LL-37與銀屑病病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

銀屑病病情嚴(yán)重程度判定:采用PASI評分法［9］對銀屑病皮疹面積和嚴(yán)重程度進(jìn)行評分。采用Spearman相關(guān)性分析法分析血清LL-37與銀屑病病情程度的關(guān)系。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗法進(jìn)行各組數(shù)據(jù)間的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1觀察組與健康對照組血清LL-37水平比較

觀察組與健康對照組血清LL-37水平分別為12.3(9.33～17.10)、9.43(7.16～11.11)ng/mL，兩組比較，P＜0.01。

2.2試驗組與對照組LL-37表達(dá)比較試驗組LL-37mRNA表達(dá)約為對照組的5.1倍，LL-37蛋白表達(dá)約為對照組的5.3倍，兩組LL-37mRNA及蛋白表達(dá)比較，P均＜0.01。

2.3血清LL-37與銀屑病病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

觀察組PASI得分平均13.7分(1.98～29.81)。血清LL-37水平與銀屑病病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r =0.515，P＜0.001)。

3　討論

LL-37主要表達(dá)于骨髓源性細(xì)胞、組織上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞及某些腺體等易與微生物接觸的部位［6］。LL-37在正常人體皮膚上一般不表達(dá)或低表達(dá)，當(dāng)皮膚受到外來刺激(外傷、感染、炎癥等)時，LL-37表達(dá)水平即大大升高［7］。這些升高的LL-37來源包括角質(zhì)形成細(xì)胞和趨化到局部的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。作為天然免疫的重要成分，LL-37在機體遭受外來感染源侵犯時可與其他抗菌肽一同迅速而有效地提供第一線防御［8］。研究［9］表明，LL-37不但可直接殺滅感染源，還可間接參與獲得性免疫中免疫細(xì)胞的趨化、細(xì)胞因子釋放及部分炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。

銀屑病是一種炎癥性皮膚病，其中Th1和Th17細(xì)胞及眾多細(xì)胞因子在其發(fā)病中起到重要作用。銀屑病皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞能分泌一系列趨化中性粒細(xì)胞和Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與IFN-γ等可調(diào)節(jié)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中LL-37的轉(zhuǎn)錄和分泌。PASI指數(shù)是臨床評價銀屑病臨床療效的常用量表，具有較高的可靠性和實用性。本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LL-37在局部皮損和血清中的表達(dá)均顯著性升高，且血清LL-37水平與PASI指數(shù)呈明顯正相關(guān)性。說明LL-37在銀屑病發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，血清LL-37可作為評價銀屑病進(jìn)展的血清學(xué)指標(biāo)。

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收稿日期:( 2015-05-10)

文章編號:1002-266X(2015)33-0087-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R758.63

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.035