劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510008)

膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD133的表達變化及意義

劉愛群，余青云，彭忠興，黃葉青，刁勝朋，程靜，王文濤，洪銘范
(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510008)

摘要:目的觀察膠質(zhì)瘤組織中miR-200b和CD(133)的表達變化，并探討其意義。方法將80例膠質(zhì)瘤患者作為試驗組、另選擇20例接受開顱手術(shù)的腦外傷或腦出血患者為對照組。采用原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測試驗組膠質(zhì)瘤組織及對照組正常大腦組織中的miR-200b與CD(133)，分析膠質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD(133)的相關(guān)性及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果試驗組miR-200b陽性表達率(32.65%，32/80)與對照組(80.00%，16/20)比較，P=0.001。試驗組CD(133)陽性表達率(67.50%，54/80)與對照組(15.00%，3/20)比較，P=0.000。試驗組miR-200b與CD(133)的表達呈負相關(guān)(r=－0.09，P=0.006)。試驗組miR-200b和CD(133)表達與患者病理分期有關(guān)(P均＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)。結(jié)論膠質(zhì)瘤組織中miR-200b低表達、CD(133)高表達，兩者均與膠質(zhì)瘤病理分期有關(guān)。

關(guān)鍵詞:腦腫瘤;膠質(zhì)瘤;微小RNA-200b;分化抗原簇蛋白133

微小RNA(miRNAs)是重要的調(diào)控因子，能調(diào)控細胞的增殖、分裂、分化、凋亡等過程。研究［1～4］表明，miR-200b在腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，對多種腫瘤具有抑制作用。CD133是干細胞和腫瘤干細胞表面特異標(biāo)志蛋白，在白血病和乳腺癌中表達上調(diào)［5，6］。研究［7］顯示，miR-200b可通過靶向調(diào)控CD133的表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲以及干細胞的形成。本研究采用免疫組化和原位雜交技術(shù)，分析膠質(zhì)瘤組織中miR-200b和CD133的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010 年3月～2014年2月收治并確診為膠質(zhì)瘤的80例患者(試驗組)，術(shù)前均未行放化療，手術(shù)切除腫瘤組織。其中男44例、女36例，年齡7～62歲、中位年齡42歲;根據(jù)WHO腫瘤分類標(biāo)準，Ⅰ級15例、Ⅱ級27例、Ⅲ級30例、Ⅳ級8例。病理診斷結(jié)果均由2名以上病理科醫(yī)生共同確診。另將20例接受開顱手術(shù)的腦外傷或腦出血患者作為對照組，其腦組織經(jīng)HE染色證實為非腫瘤組織。兩組一般資料具有可比性。

1.2主要試劑原位雜交檢測試劑盒與ElivisionTMPlus二步法免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司，地高辛標(biāo)記的miR-200b探針序列購自美國Exiqon公司，CD133單克隆抗體購自CST公司。

1.3miR-200b與CD133檢測及分析方法①原位雜交檢測膠質(zhì)瘤組織與正常大腦組織中的miR-200b。切片后脫蠟至水。3%胃蛋白酶消化20～30 min，水洗后4%甲醛固定。按miRNAs原位雜交說明，探針用無酶水稀釋，稀釋比例為1∶500，先用預(yù)雜交液于55℃預(yù)雜交2 h后再用地高辛標(biāo)記的miR-200b探針于55℃進行雜交過夜。次日于不同濃度SSC緩沖液中徹底洗滌干凈。室溫封閉30 min。生物素化鼠抗地高辛室溫孵育2 h。DAB顯色并于鏡下控制顯色時間，蘇木素復(fù)染細胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。②免疫組化檢測膠質(zhì)瘤組織與正常大腦組織中的CD133。采用ElivisionTMPlus二步法，切片后脫蠟至水。按需要對切片進行高壓修復(fù)，冷卻至室溫，PBS液洗凈。每張切片加50 μL一抗體，室溫下孵育4℃過夜，PBS洗凈后每張切片加50 μL生物素標(biāo)記的二抗體，室溫下孵育10 min。PBS洗凈，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS洗凈后DAB溶液顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木素復(fù)染細胞核，充分水洗，中性樹膠封片保存。③免疫組化和原位雜交結(jié)果分析。miR-200b 與CD133呈棕黃色顆粒的陽性信號定位于膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤細胞的細胞質(zhì)與細胞核中。綜合陽性信號的染色強度和分布范圍進行半定量，陽性強弱按以下標(biāo)準判斷［1］。每個標(biāo)本于高倍光鏡下觀察5個具有代表性的視野，對陽性染色的細胞比例和染色程度進行統(tǒng)計。組織細胞陽性染色程度計分:陰性計1分;+ 計2分;++計3分;+++計4分;組織細胞陽性細胞分布比例計分:染色細胞小于10%計1分;染色細胞10%～50%計2分;染色細胞51%～75%計3分;染色細胞大于75%計4分。兩種得分相乘，＜8為低表達，≥8為高表達。顯微攝像后運用病理圖像分析系統(tǒng)對光密度值進行檢測，結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗;計數(shù)資料比較用χ2檢驗，相關(guān)性分析用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

試驗組miR-200b陽性表達率(32.65%，32/80)與對照組(80.00%，16/20)比較，χ2=10.26，P=0.001。試驗組CD133陽性表達率(67.50%，54/80)與對照組(15.00%，3/20)比較，χ2=17.99，P=0.000。試驗組miR-200b與CD133的表達呈負相關(guān)(r=－0.09，P=0.006)。試驗組miR-200b與CD133的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。miR-200b和CD133表達與與患者病理分期有關(guān)(P均＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)。

3　討論

miRNAs通過調(diào)控其靶基因影響一系列mRNAs的表達，從而在生理和病理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究［8］表明，大量的miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程(細胞的增殖、干細胞自我更新以及分化)中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。大量miRNAs的異常表達與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如miR-34a［9］、miR-203［10］、miR-22［11］在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào); miR-372［12］、miR-17［13］、miR-221/222［14］在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，為膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的重要標(biāo)志物。由此可見，具有癌基因或抑癌基因樣作用的miRNAs可能與人類膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的表達與多形性膠質(zhì)瘤母細胞瘤(GBM)患者的總生存期和疾病進展的時間相關(guān)。Srinivasan等［15］分析了222例同時進行了放化療再輔以TMZ治療的GBM患者的10個miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-106a和miR-17-5p在長期存活的患者中高表達，而miR-221/222、miR-148a、miR-31、miR-146b和miR-193a在短期存活的患者中高表達。一些miRNAs如miR-181c、miR-21、miR-221/222、miR-195、miR-146a與膠質(zhì)瘤細胞放化療抵抗相關(guān)，表明這些miRNAs具有預(yù)測特性。

miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，其中miR-200b-200a-429簇位于1p36染色體，而miR-200c-141簇位于12p13染色體［16］。在功能上，miR-200家庭成員可以調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子，包括Zeb1、Ets-1、Suz12［17］。在膠質(zhì)瘤中，miR-200b通過靶向CREB1抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖［18］。Tang等［1］研究顯示，miR-200b在胃癌組織中表達下調(diào)，并且其表達狀態(tài)與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后生存相關(guān)。然而Cao等［19］顯示，miR-200b在卵巢癌中表達上調(diào)，并且與患者的臨床分期、組織分化程度以及預(yù)后生存相關(guān)。CD133是一種常見的腫瘤干細胞標(biāo)志物，最初在造血干細胞中被發(fā)現(xiàn)。CD133在多種實體腫瘤中高表達，如乳腺癌［6］、結(jié)腸癌［20］、肺癌［21］，并可作為腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤組織中miR-200b低表達、CD133高表達，miR-200b的陽性表達率隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而降低、CD133的陽性表達率隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增高?？梢姡z質(zhì)瘤組織中miR-200b與CD133的表達與患者病情程度有關(guān)。

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(收稿日期:2015-01-29)

通信作者:洪銘范

基金項目:廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項課題(A2013321) ;省企業(yè)技術(shù)研發(fā)與升級改造專項基金項目(B2013B0218011251)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0053-03

文獻標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.019