彭濤，李曙光

(1河北北方學院，河北張家口075000;2河北北方學院附屬第一醫(yī)院)

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基化酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到特定堿基上的過程。不同類型的腫瘤都有其特定的DNA甲基化模式，在不同腫瘤或同一腫瘤的不同發(fā)生、發(fā)展階段，基于基因組DNA上CpG島甲基化狀態(tài)的差異，構成了腫瘤特定的DNA甲基化譜。應用DNA甲基化芯片研究胃癌DNA甲基化情況，可從表觀遺傳學角度明確DNA甲基化在胃癌形成過程中的作用，進一步明確胃癌形成的分子機制，為胃癌的早期診斷、治療及預后提供理論依據(jù)。

1 DNA甲基化與腫瘤的關系

研究發(fā)現(xiàn)，除了基因突變之外，表觀遺傳改變也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。表觀遺傳學是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達發(fā)生可遺傳的改變，這種改變在細胞生長發(fā)育與增殖過程中能繼續(xù)傳遞［1］;表觀遺傳修飾的改變會使基因表達發(fā)生異常，導致疾病的發(fā)生。DNA甲基化是哺乳動物基因組中最為常見的表觀遺傳學事件之一。正常的DNA甲基化可維持機體的正常功能，如基因組結構的穩(wěn)定、胚胎正常發(fā)育以及細胞分化等［2，3］;而異常的DNA甲基化則會導致腫瘤的發(fā)生［4］。CpG島是基因啟動子區(qū)的一段長約0.5～2 kb的CpG富集區(qū)，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)大約有27 800個CpG島，約60%的基因在5’端有CpG島［5］。CpG島在正常情況下是不甲基化的，并由各種轉錄因子控制基因的表達。異常甲基化包括高甲基化和低甲化，前者指正常組織中未甲基化的位點被甲基化，后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點去甲基化。DNA甲基化模式的改變常常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的早期，并且可在同一腫瘤中同時發(fā)生。啟動子區(qū)CpG島高甲基化通過使抗細胞增殖基因、凋亡基因、抗血管生成基因、DNA修復基因和抗轉移基因等的轉錄沉寂與腫瘤的形成具有相關性［6］?；蚪M低甲基化水平不但可以激活原來保持沉默狀態(tài)的基因(尤其是原癌基因)的表達，而且還可引起染色質(zhì)改變，進而導致遺傳不穩(wěn)定性增加;而抑癌基因啟動子區(qū)(CpG島區(qū))局部過度甲基化導致基因轉錄沉默。在腫瘤組織中，DNA甲基化水平的改變導致原癌基因的激活或抑癌基因的失活。全基因組水平DNA低甲基化使沉默的原癌基因激活，而高甲基化使DNA轉錄抑制，導致抑癌基因、DNA錯配修復基因、細胞周期調(diào)控基因低表達或不表達，從而引起腫瘤的發(fā)生［7～9］。不同類型的腫瘤中，檢測到發(fā)生甲基化的基因及甲基化的程度也不相同。如Wilhelm等［10］發(fā)現(xiàn)LINE1的低甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關。Uhm等［11］報道膽管癌的發(fā)生與腫瘤抑制因子CpG島啟動子甲基化異常有關。

2 DNA甲基化與胃癌的關系

2.1 DNA高甲基化與胃癌 DNA高甲基化是指在最初未甲基化位點的甲基化增益，通常會導致穩(wěn)定的轉錄沉默，調(diào)節(jié)基因的表達。常見DNA高甲基化為轉錄因子4(TCF4)啟動子甲基化。使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)和焦磷酸測序(PS)方法對120例胃癌組織和40例正常胃黏膜組織中的TCF4啟動子甲基化程度實施評估，結果顯示，TCF4的甲基化頻率在進展期胃癌與早期胃癌、胃癌與正常胃黏膜之間均存在統(tǒng)計學差異。通過PS顯示TCF4甲基化狀態(tài)與腫瘤大小、Lauren分型、浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤淋巴結轉移階段有顯著相關性［12］。

2.2 DNA低甲基化與胃癌 DNA低甲基化是在人類腫瘤中識別的最初的表觀遺傳異常。最新的高分辨率全基因組研究證實，DNA低甲基化與基因組高甲基化相伴行，只是通常發(fā)生在不同的序列。越來越多的證據(jù)表明，癌基因低甲基化可導致基因再次激活。Shin等［13］報道，胃癌組織中MOS基因啟動子甲基化與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移以及彌漫型具有相關性。通常正常組織中 c-myc基因3’端CCGG是被甲基化的，低甲基化導致該基因高表達，引起腫瘤的發(fā)生。Sharrard等研究也證實，該基因在40%～50%的胃癌組織中甲基化水平降低。提示低甲基化是胃黏膜細胞發(fā)生癌變的重要遺傳學事件之一。

2.3 DNA甲基化與胃癌的早期診斷 DNA甲基化檢測有助于胃癌的早期診斷。Bernal等［14］采集了32例胃癌患者的腫瘤組織標本，采用甲基化特異性PCR方法對24個基因進行了甲基化分析，其中一半以上患者的11個基因出現(xiàn)了高度甲基化，8個基因與胃印戒細胞癌在統(tǒng)計學上具有相關性;通過和無癥狀的對照組相比較，篩選出Reprimo為胃癌早期檢測的潛在生物標記物。p16基因(CDKN2a/INK4a)是一個重要的抑癌基因，除了基因缺失和點突變的p16基因，p16基因失活與啟動子甲基化有關［15］。Abbaszadegan 等［16］研究表明，在胃癌早期，p16啟動子發(fā)生高甲基化，并且與胃癌惡性程度具有相關性，其可作為胃癌早期檢測的標志物。在血清標本中，利用甲基化特異性酶鏈反應對候選基因的啟動子區(qū)的甲基化進行測試，包括胃癌組58例，癌前病變46例，正常對照組30例。通過分析，獲得了82個甲基化的基因，其中5個基因(BCAS4，CHRM2，F(xiàn)AM5C，PRAC，MYLK)被定為候選基因。從正常組織→癌前病變→胃癌，3個基因(CHRM2，F(xiàn)AM5C，MYLK)被進一步確認顯示甲基化率升高。從術前到術后評估，除了CHRM2、MYLK和FAM5甲基化程度明顯降低，F(xiàn)AM5C和MYLK甲基化聯(lián)合檢測與單一基因檢測相比較，在胃癌診斷和預警方面具有較高的敏感度和特異性。FAM5C與 MYLK聯(lián)合下的甲基化狀態(tài)與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、腫瘤淋巴結轉移以及TNM分期具有相關性。因此，高甲基化FAM5C和MYLK可以作為潛在的早期診斷和預警的生物標記。

2.4 DNA甲基化與胃癌預后和治療的關系 DNA甲基化可作為胃癌預后判斷的重要指標。Sugita等［17］對80例使用氟尿嘧啶類藥物治療的胃癌轉移或復發(fā)患者與無甲基化患者進行比較，BNIP及DAPK基因甲基化患者的無瘤生存時間及總體生存時間較短，且甲基化患者的化療敏感性相對較差。Park等［18］發(fā)現(xiàn)，基因組中甲基化程度較高的胃癌患者預后較差。Sakakuar等［19］采用 RTQMSP法對胃癌患者外周血RUNX3的甲基化情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)RUNX3甲基化的患者較正常組預后較差。由于表觀遺傳修飾具有可逆性，因此可利用這一特性預防和治療癌癥。DNA甲基化是通過DNA甲基化轉移酶發(fā)揮作用，去甲基化藥物主要是指DNA甲基化轉移酶抑制劑，如5-氮胞苷和5-氮-2-脫氧胞苷。其主要通過共價鍵與DNA甲基化轉移酶結合，形成不可逆的復合物，從而使基因組甲基化水平降低，使高甲基化的抑癌基因重新發(fā)揮作用。5-氮-2-脫氧胞苷對骨髓增生異常綜合征的治療作用，使其成為第一個被美國FDA批準上市治療惡性腫瘤的去甲基化藥物，通過對41例白血病患者應用該藥物后顯示，大多數(shù)患者臨床癥狀較前明顯減輕［20，21］。在乳腺癌、膀胱癌等體外培養(yǎng)的腫瘤細胞株中，5-氮-2-脫氧胞苷可逆轉多種基因(如 APC、p15、Rb、p16、E-cadherin等)啟動子的甲基化狀態(tài)，對腫瘤發(fā)揮作用。在胃癌組織中，5-氮-2-脫氧胞苷可逆轉多種基因的甲基化狀態(tài)，如 hMLH1、RASSF1A和 P16基因等［22］。

2.5 胃癌DNA甲基化的檢測 胃癌相關基因啟動子的異常甲基化是腫瘤發(fā)生的重要敏感性生物指標。目前許多方法被用于測定CpG島甲基化狀態(tài)，如限制性內(nèi)切酶PCR、重亞硫酸鹽基因組DNA測序、甲基化特異性 PCR(MSP)、Southern印跡雜交等。甲基化限制性內(nèi)切酶法是經(jīng)典的甲基化情況分析法，主要根據(jù)一些限制性內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA序列的原理［23］。內(nèi)切酶包括HpaⅡ和MspⅠ，這對酶可識別CCGG位點，鑒于兩種酶對甲基化敏感程度不同，二者分別為鑒別甲基化序列和識別CCGG位點。這種方法既簡便又便宜。其缺點是:由于非該序列中的CG容易被忽略，因此可靠性欠佳。重亞硫酸鹽基因組DNA測序是通過重亞硫酸鈉使非甲基化的C經(jīng)過脫氨基轉化成U，而DNA甲基化的C不發(fā)生變化，經(jīng)過PCR擴增，所有的U轉化為T，而甲基化胞嘧啶殘基仍為胞嘧啶形式。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過測序并且單個CpG位點的甲基化狀態(tài)通過和給定啟動子的非修飾序列進行比對分析。通過對高甲基化的啟動子CpG位點的定位，明確其在調(diào)控腫瘤相關基因轉錄中的重要作用。以亞硫酸氫鹽處理為基礎的方法是經(jīng)典的甲基化研究方法，但是費時費力且只能以特定的基因為目標，對于甲基化譜的研究并不適用，因此建立有效可靠的高通量方法用于早期癌診斷的甲基化檢測具有重要意義［24］。Zheng 等［25］利用甲基化芯片確定候選基因后，并利用MSP技術進行組織和血清中的甲基化狀態(tài)的評價。使用5-aza-dC處理胃癌細胞株，96 h后，通過使用RT-PCR技術對mRNA的表達進行了去甲基化的效果的評價。結果顯示，與健康人相比較，在胃癌患者的組織和血清中，觀察到BX141696，WT1，CYP26B1，KCNA4等基因具有較高的甲基化。5-aza-dC干預后治療在胃癌細胞株的mRNA表達這些基因的水平恢復。這項研究強調(diào)的潛在應用，篩選候選基因的DNA甲基化芯片技術具有重要的價值。

鑒于目前胃癌DNA甲基化的研究多集中于單個或幾個基因，且DNA甲基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移過程中的作用尚不明確。因此，明確DNA甲基化和其表達與胃癌組織學類型、腫瘤的部位、浸潤深度、淋巴結和腹膜轉移及預后的關系，具有重要意義。建立胃癌DNA甲基化譜，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳性機制，并擬建立胃癌分子分期及判斷預后的分子標記物群，并針對靶分子設計干預措施，為胃癌的治療開辟新的路徑。

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