李兆華　楊金寶　王成森　都振玉　申穎（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院山東濰坊261061）

鴨疫里默氏桿菌的診斷研究進展

李兆華楊金寶王成森都振玉申穎（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院山東濰坊261061）

我國是一個養(yǎng)鴨大國，養(yǎng)鴨業(yè)在我國的農業(yè)經濟中占有著重要的地位，也是人們生活所需肉蛋的重要來源之一。隨著該產業(yè)向規(guī)?；⒓s化方向的發(fā)展，其經濟效益明顯提高，但同時一些重要的疫病正在使其遭受重大經濟損失并對其進一步的發(fā)展構成嚴重的威脅。其中鴨疫里默氏桿菌病是目前對世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成危害最為嚴重的傳染病之一。鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的接觸性傳染病，由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起，主要侵害雛鴨、雛火雞等多種禽類的急性或慢性的接觸性傳染病，又稱為“新鴨病”、“鴨疫綜合征”、“鴨敗血癥”、“鴨傳染性漿膜炎”、“鴨疫巴氏桿菌感染”等，鵝的鴨疫里默氏桿菌感染曾被稱為鵝流感(Goose influenza)和鵝滲出性敗血癥(Septisemia anseru exsudative)[1]。該病以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和干酪性輸卵管炎為特征，呈急性或慢性敗血癥過程，此外還可引起干酪性輸卵管炎、腦膜炎、結膜炎和關節(jié)炎[2]。其發(fā)病率在5%～90%、病死率一般在1%～80%，高峰時可達90%甚至100%，耐過鴨多生長遲緩成僵鴨。該病在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎都有流行，給世界養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一[3]。目前該病呈全球流行態(tài)勢，嚴重危害各國養(yǎng)鴨業(yè)，成為動物傳染病學、獸醫(yī)微生物學的研究熱點。

1　形態(tài)特征

鴨疫里默氏桿菌為革蘭氏陰性小桿菌，無芽胞，不能運動。純培養(yǎng)物涂片，菌體除呈桿狀外，有的為橢圓形，多數單個存在，少數成雙排列或呈鏈狀排列。瑞氏染色呈兩極著色特征。大小為0.3～0.5μm×0.7～6.5μm，偶見個別菌體呈長絲狀，長達11～24μm。經墨汁負染見有夾膜，涂片經瑞氏染色可見部分菌體兩極濃染。電鏡下細菌的周邊莢膜是一電子透明層，細菌胞壁為1條電子致密層，細胞膜有3層結構，外層與內層呈電子致密層[4]。細胞膜與細胞層之間有一明顯的間隙，在菌體周邊有圓形或卵圓形空泡狀結構，位于菌體一端，部分RA頂端或側面還有芽狀贅生物[5]。

2　流行病學特點

鴨疫里默氏桿菌的感染宿主比較廣，主要引起家鴨和鵝感染，也可引起野鴨、雉雞、火雞、鵪鶉、天鵝和鴿感染發(fā)病。但自然條件下最易感的是鴨，不同地區(qū)和鴨場發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染的日齡有所不同，但通常1～8周齡的鴨都對本菌易感，2～3周齡的鴨最易感，由本菌感染引起的死亡多發(fā)生于2～4周齡；Leibovitz和Marshall認為5周齡以上的鴨將逐漸產生對本菌感染的抵抗力，8周齡以上者很少見此病發(fā)生。5周齡以下雛鴨一般在出現癥狀后1～2d死亡，較大的鴨可能存活較長時間，發(fā)病不死的鴨往往成為因發(fā)育不良僵鴨(平均體重比正常鴨低1～1.5kg，甚至不到正常鴨的一半)。本病發(fā)病率和死亡率相差也較大，發(fā)病率在5%～90%，死亡率為5%～80%或更高。新疫區(qū)的發(fā)病率和死亡率明顯高于老疫區(qū)，日齡較小的鴨群發(fā)病及死亡率明顯高于日齡較大的鴨群，1日齡雛鴨死亡率可達90%以上。該病潛伏期的長短與菌株的毒力、感染途徑以及應激等因素有關，一般為1～3d或1周左右。本病一年四季均可發(fā)生，但以低溫、陰雨、潮濕的天氣及冬春季節(jié)較為多見。本病的發(fā)生、流行以及造成危害的嚴重程度與應激因素關系密切，感染未受應激的鴨，通常不表現臨床癥狀或癥狀輕微。病鴨是本病主要的傳染源；其次是帶菌鴨及病死鴨處理不當造成空氣污染也可導致疫病流行；地面育雛也可因墊草潮濕不潔被細菌污染了，反復使用后，一旦小鴨腳掌擦傷則亦可感染；鴨大腸桿菌病、巴氏桿菌病、鴨病毒性肝炎等可促進本病的發(fā)生。本病可通過污染的飼料、飲水、飛沫、塵土，經呼吸道、消化道、刺破的足部皮膚的傷口、蚊子叮咬等多種途徑傳播，庫蚊是RA的重要傳播媒介。本病經蛋垂直傳播的證據不足。郭予強[6]等從疫區(qū)兩個鴨場的200多例死胚和1日齡雛鴨卵黃囊中也均未分離到RA。

3　臨床癥狀

最常見的臨床癥狀是精神沉郁、流眼淚和流鼻液、輕度咳嗽和打噴嚏、排綠色稀糞、共濟失調、頭頸振顫和休克。最急性病例往往看不到明顯癥狀而突然死亡。急性病例主要發(fā)生于2～3周齡雛鴨，主要表現為精神沉郁，共濟失調，頭頸震顫，有的一側或兩側跗關節(jié)腫大，腿軟不愿走動或行動蹣跚，不食或少食，下痢，眼有漿液性或粘液性分泌物流出，常使眼周圍羽毛粘連，嚴重時脫落。流鼻涕、甩頭、氣喘、咳嗽、張口呼吸，可聽到喘鳴聲。死前一般有歪頭、抽搐、仰臥作劃水狀或角弓反張等神經癥狀，病程1～3d。慢性病例主要發(fā)生在4～8周齡的小鴨，表現不食、少食、精神沉郁、困倦、腿軟、不愿走動、站立呈犬坐式、共濟失調或病鴨消瘦死亡，病程一周以上不死的患病鴨，往往發(fā)育不良，成為僵鴨。按病程，本病可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。慢性型多見于日齡較大的小鴨，在同一病鴨群中，病程超過1周，可能同時或先后出現多種病型，但在門診病例中，最急性型很少見，最突出的臨床癥狀有6點：（1）腿軟無力，不愿行走，常伏臥，步態(tài)不穩(wěn)，甚至癱瘓；（2）拉白色稀糞，少數綠便；（3）部分病鴨有呼吸道癥狀，咳嗽，打噴嚏；（4）眼鼻分泌物增多，有漿性、粘性或膿性分泌物，常使眼眶周圍的羽毛粘連，民間稱“戴眼鏡”。分泌物凝結后常堵塞鼻孔，使患鴨表現呼吸困難；（5）出現神經癥狀，精神沉郁，頸震顫，點頭，角弓反張，搖尾抽搐，臨死前表現陣發(fā)性痙攣；（6）病鴨生長緩慢，發(fā)育不良，個別病鴨體重反而減輕。肉眼變化的主要特征是廣泛性的多少不等的纖維素性滲出物，可發(fā)生于全身漿膜面，故本病又有“傳染性漿膜炎”之稱。心包液增多，可見數量不等的白色絮狀物，心外膜表面覆蓋有灰黃色纖維素性滲出物。病程長者，纖維素性滲出物凝結，使心外膜與心包膜粘連，難以剝離。肝臟表面有灰白色或灰黃色纖維素膜覆蓋，極易剝離。氣囊混濁增厚，有纖維素性滲出物附著，有的與胸腹壁粘連。脾臟多腫大，表面有纖維素性膜。有神經癥狀的病鴨可見腦膜充血、水腫，也可見到纖維素性沉著物附著。慢性病鴨可見一側或兩側跗關節(jié)和脛、跖關節(jié)腫大，關節(jié)液增多。皮膚病變多為背下部或肛門周圍的壞死性皮炎，皮膚或脂肪呈黃色，切面呈海綿狀，似蜂窩狀。跗關節(jié)腫脹，觸之有波動感，關節(jié)液增多，粘稠，乳白色。有的病鴨可見腹腔積液，呈橙黃色，間或有絮狀物。

4　病理變化

最明顯的病變是全身漿膜表面的纖維素性滲出，以心包、肝臟表面和氣囊最為明顯，構成纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，滲出物中除纖維素外，還有少量的炎性細胞，主要是單核細胞和異嗜細胞。心臟：病程較急的病例可見心包積液，心外膜表面覆有纖維素性滲出物；病程較長者，則心包囊有淡黃色纖維素充填，使心包膜與心外膜粘連。肝臟：腫大質脆，肝被膜有一層纖維素性滲出物，易剝離，膽囊腫大。病程較長者肝表面滲出物呈淡黃色團塊，或被機化。組織學觀察，肝外膜可見纖維素滲出和嗜異染細胞浸潤，同時可見輕微的肝細胞腫脹，水泡變性、脂肪變性和壞死[7]。氣囊：纖維性氣囊炎在胸、腹氣囊均有發(fā)生，氣囊增厚混濁，尤其以頸胸氣囊較為嚴重，可見淡黃色纖維素性滲出物，甚至與胸腹壁粘連，滲出物中主要為單核細胞。

5　診斷

臨床診斷主要是依據流行病學特征、典型臨床癥狀、病理變化以及有多種發(fā)病應激因素存在，可以初步做出疑似診斷，但確診本病必須要做RA的分離和鑒定。實驗室檢測主要是細菌學檢查、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗、凝集試驗、熒光抗體試驗、間接ELISA、PCR、間接免疫酶組織化學法等。

5.1臨床診斷

鴨疫里默氏桿菌感染主要發(fā)生于家鴨，1～8周齡鴨高度敏感，惡劣的環(huán)境條件或并發(fā)感染可促發(fā)感染，5周齡以下雛鴨一般在出現癥狀后1～2d死亡，較大的鴨可能存活較長時間。該病給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的損失[4]，表現為發(fā)病率較高，可達到90%以上，尤以2～3周齡的雛鴨為高，死亡率受多種因素的影響差異很大，常為10%～20%，但是也有高達60%～70%者。在良好的衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理條件下，呈散發(fā)性發(fā)生時，其發(fā)病率和死亡率很低，不超過5%。慢性耐過鴨主要表現神經癥狀，導致殘鴨和僵鴨。此外，本病對鵝、火雞等也造成很大的危害[8][9]。傅童生等[10]用常規(guī)方法，對人工感染RA的小鴨進行17項生理生化指標進行測定，結果顯示，病理血液中血紅蛋白含量，紅細胞數，淋巴細胞數，血清無機磷，總蛋白、球蛋白的含量及血清堿性磷酸酶活性顯著下降，血液中中性粒細胞數增多，血清谷草轉氨酶和乳酸脫氫酶活性顯著升高，表明感染RA的小鴨肝臟、心臟等器官受到嚴重的損傷。

5.2實驗室診斷

5.2.1細菌的分離鑒定從發(fā)病鴨和死亡鴨極易分離到鴨疫里默氏桿菌，適于分離的組織有：心血、腦、肝臟、脾臟，膽囊、氣囊、骨髓、肺以及病變中的滲出物等。在對鴨疫里默氏桿菌病進行診斷時往往易與鴨大腸桿菌病和鴨沙門氏菌病相混淆。病理變化均為纖維素心包炎、纖維素氣囊炎、纖維素性肝周炎、脾臟膽囊腫脹等。故必須進行細菌分離培養(yǎng)與鑒定。將RA在胰酶大豆瓊脂上培養(yǎng)24h形成圓形凸起、透明、呈露珠樣，直徑為0.5～1.5mm的菌落，用斜射光觀察發(fā)綠色光，鴨大腸桿菌菌落為2～5mm，鴨沙門氏菌菌落為2～3mm，且后兩者在TSA上的培養(yǎng)物均為灰白色；進一步接種麥康凱平板可馬上將三者區(qū)分，鴨疫里默氏桿菌不生長；鴨大腸桿菌呈紅色菌落，鴨沙門氏菌呈白色菌落。此法簡便、快速，對于鑒別診斷3種易混淆的常見細菌病是十分必要的。收集發(fā)病死亡或瀕臨死亡的急性病例的肝臟、心臟，無菌挑取急性病例的肝組織、心血(心血分離的成功率與純度高于肝臟)，劃線接種于馬丁瓊脂平板或巧克力瓊脂等培養(yǎng)基中，置于體積分數為5%～10%的CO2蠟燭罐中，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)特征。鴨疫里默菌外觀呈光滑、圓形、饅頭狀、邊緣整齊的半透明狀菌落，直徑約0.5～ 1mm。在需氧條件下培養(yǎng)生長不良。挑取可疑菌落涂片，用革蘭氏、美藍染色，油鏡下觀察。由于鴨疫里默菌病的癥狀和病理變化與鴨大腸埃希菌病、鴨沙門菌病很相似[11]，故必須進行細菌分離培養(yǎng)與鑒定才能加以鑒別。將RA在胰酶大豆瓊脂上培養(yǎng)24h形成圓形凸起、透明、呈露珠樣，直徑為0.5～1.5mm的菌落，用折射光觀察發(fā)綠色光，鴨大腸埃希菌菌落2～5mm，鴨沙門菌菌落為2～3mm，且后兩者在TSA平板上的培養(yǎng)物均為灰白色；進一步接種麥康凱平板可馬上將三者區(qū)分，鴨疫里默菌不生長；鴨大腸埃希菌呈紅色菌落，鴨沙門菌呈白色菌落。此法簡便、快速，對于鑒別診斷3種易混淆的常見細菌病是十分必要的[12]。

5.2.2凝集試驗凝集試驗分為玻片凝集試驗和試管凝集試驗兩種。應用玻片凝集試驗可以實現細菌的快速鑒定，并對分離到的菌株的血清型進行大范圍的粗略篩選，但要準確定型還必須依賴于試管凝集試驗。試管凝集試驗可以更為準確的進行血清型鑒定、血清流行病學調查以及抗體效價檢測。當供試菌與參照菌的凝集效價相等或僅差1個度時，一般可認為二者屬于相同的血清型；當凝集效價相差3個或3個以上滴度時，一般可認為該二者屬于不同的血清型。

5.2.3PCR診斷用PCR方法檢測RA的研究一般基于16SrRNA基因序列和外膜蛋白A(OmpA)基因序列。作為核糖體重要組成部分的16SrRNA是目前所選用的主要系統(tǒng)發(fā)育標記。對代表不同血清型和亞型的26個菌株進行了16SrRNA序列分析，發(fā)現不同菌株該基因的序列相似性為99%～100%。對PCR產物進行HaeIII酶切分析，發(fā)現均為清晰的5條帶的帶型。因此，這些結果可作為鑒定RA分離株的一項分子指標。楊建遠等[13]根據GenBank中25株鴨疫里默菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列，在其高度保守區(qū)設計了一對特異性引物，成功地建立了鴨疫里默菌的快速、準確PCR檢測方法。此法可直接將臨床送檢的可疑病料的腦、肝少量剪碎成米粒大小直接放入加有一定量小牛血清的液體培養(yǎng)基中，增殖8h便能以全菌體法擴增檢測出陽性病例，并與生化鑒定結果的符合率達100%，具有準確、可靠、快速、經濟等優(yōu)點，可用于臨床檢測和流行病學調查。

5.2.4免疫酶技術該方法可用于檢測血清中的RA 抗體效價，從而對疫苗免疫效果進行評價或者調查流行情況。張鶴曉等[14]用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立間接ELISA方法，檢測鴨血清中抗RA抗體。胡清海[16]和方鵬飛[15]采用脂多糖(LPS)作為包被抗原，建立了間接ELISA方法來檢測血清中抗體，人工感染RA的鴨在感染72h即可檢出抗體。該方法敏感性遠強于凝集試驗，十分快速敏感、特異性極強。但由于RA的血清型十分復雜，此法只適用于對同一血清型的不同菌株的抗體進行檢測，所以在應用中也具有一定的局限性。

5.2.5熒光抗體技術熒光抗體技術(fluorescence antibody technique，FAT)又可分為直接熒光抗體法和間接熒光抗體法。應用直接熒光抗體法檢測急性病例，涂片標本上可見黑暗的背景有帶綠色熒光的菌體，從肝、腦分離的細菌及組織涂片抗體染色證明，肝臟檢出菌數多，并認為死亡小鴨的病程與細菌抗原的定位和菌體數量的多少有關[17]。Marshall等[18]報道用熒光抗體技術可檢出培養(yǎng)物、臨床病料、自然或人工感染組織中的RA。此法迅速而且特異性強。此法只需取病料涂片、固定、特異熒光染色、鏡檢，十分快速、直觀，特異性強，可用于病料中病原菌的檢測和鑒定，用以正確的區(qū)分大腸埃希菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌。直接熒光抗體法和間接熒光抗體法均有種的特異性，卻沒有型的特異性，可以用于菌種的鑒定，但不能用于型的鑒別。

5.2.6間接免疫酶組織化學法劉維平等應用鴨源血清1型鴨疫里默菌作為抗原，免疫兔制備兔抗RA的IgG并加以純化，優(yōu)化反應條件，建立了檢測雛鴨感染鴨疫里默菌的間接免疫酶組織化學法(indirect immuno histochemical technique)，在對雛鴨人工感染RA病例和疑似病例的各組織器官進行檢測中發(fā)現，RA抗原分布于細胞漿、組織間隙和血液。該法特異、直觀、敏感，最大優(yōu)勢是切片中的細節(jié)比熒光染色清楚得多，能夠對抗原進行精確定位，可對人工感染和臨床感染的雛鴨RA進行診斷，研究RA致病機理。

6　防治

藥物治療是防治該病的重要措施之一[19]，其中主要以抗生素和磺胺類藥物為主。一旦發(fā)病，按藥敏試驗結果，確定用藥，進行肌肉注射，一般2～3天即可治愈。但是由于該菌極易產生耐藥性，且不同血清型以及同型的不同菌株對抗菌藥物的敏感性差異大，而藥敏試驗在臨床治療上又得不到普遍應用，所以盲目用藥、治療效果差甚至治療失敗的情況經常發(fā)生，而藥物防治成本本身較高，這就增加了養(yǎng)殖成本，降低了效益。接種疫苗也是防治本病較為理想的手段，但RA疫苗的研制尚處于起步階段，僅取得了一些有效果的探索。

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（2015–07–21）