山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△# 史艷春△ 劉芳芳△

不同分析技術(shù)對不同類型標(biāo)本的EGFR基因突變檢測分析比較*

山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)中藥制劑室 (太原 030013)

朱秀卿 閻克里△#史艷春△劉芳芳△

目的： 比較DHPLC法和ARMS技術(shù)檢測非小細(xì)胞肺癌患者3種不同類型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。方法：收集50例非小細(xì)胞肺癌患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本。分別用DHPLC法和ARMS技術(shù)同時檢測其3種不同類型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況。再用直接測序法來檢驗以上3種類型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。結(jié)果：DHPLC法與直接測序法結(jié)果大致相同，ARMS技術(shù)檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標(biāo)本的檢出率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，石蠟切片標(biāo)本和血液標(biāo)本的檢出率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),(P<0.05)。ARMS技術(shù)中3種類型標(biāo)本的檢出率相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 ：ARMS技術(shù)檢測新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測序法，全血標(biāo)本的DHPLC法可作為EGFR基因的初篩檢測， ARMS技術(shù)可用于無法確認(rèn)的EGFR突變基因檢測。

表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)表達于正常上皮細(xì)胞表面，但許多腫瘤中常有突變型EGFR的存在，從而導(dǎo)致EGFR的過表達，EGFR的過表達和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差等有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18到21外顯子，其中以19和21號外顯子突變?yōu)橹?，覆蓋突變達90%[2]。

肺癌是我國乃至世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞型肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)、腺癌、大細(xì)胞癌等。一部分非小細(xì)胞型肺癌患者對EGFR-TKI治療敏感，由于NSCLC患者的EGFR基因突變與酪氨酸激酶區(qū)域密切相關(guān)[3]。本研究小組就DHPLC法、ARMS法和直接測序法對EGFR 基因突變的檢測及其對于不同標(biāo)本的檢出率進行研究分析，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取我院自2014年5月至2015年5月期間收治入院的非小細(xì)胞肺癌患者50例為研究對象(均經(jīng)我院病理科報告為病理診斷NSCLS患者)，其中男性37例(占74%)，女性13例(占26%)；年齡31～79歲，平均 49.2±12.7歲；包括鱗癌21例、腺癌18例、腺磷癌6例、細(xì)支氣管肺泡癌3例、粘液表皮樣癌2例；其中有吸煙史者38例，無吸煙史者12例。分別收集以上患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本各50例。

2 方 法

2.1 主要儀器設(shè)備與試劑：DNA 提取試劑盒，超凈工作臺，WAVER核苷酸片段分析儀(TRANSGENOMIC公司)，PCR儀(MJ Research公司)，移液器、低溫離心機(Eppendorf公司)，dNTP Mix(MBI Fermentas公司)，超高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen公司)，PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)；7500實時PCR操作系統(tǒng)，全自動多功能酶標(biāo)檢測儀(Thermo 公司)，ADx?-EGFR試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)等等。

2.2 實驗方法：分別用DHPLC法和ARMS技術(shù)同時檢測50例非小細(xì)胞肺癌患者新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本中的EGFR基因的突變情況。再用直接測序法來檢驗以上3種類型標(biāo)本的EGFR基因突變情況。對比分析上述3種類型標(biāo)本的不同檢測方法的EGFR基因突變檢測結(jié)果，比較以上DHPLC法和ARMS技術(shù)兩種檢驗技術(shù)EGFR基因突變的檢出率、比較DHPLC法和ARMS技術(shù)兩種檢驗技術(shù)與直接測序法檢測的差異及3種不同標(biāo)本的EGFR基因突變檢出率。評估最適合臨床應(yīng)用于EGFR-TKI靶向治療前后的EGFR基因突變的檢測方法及標(biāo)本類型。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件卡方檢驗對以上3種方法EGFR突變檢出率的差異進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用c2檢驗，以百分率(%)來表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

用DHPLC法檢測50例非小細(xì)胞肺癌患者新鮮肺癌組織標(biāo)本、石蠟切片和血液標(biāo)本中的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本12例(占24%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標(biāo)本11例(占22%)；用ARMS技術(shù)檢測50例非小細(xì)胞肺癌患者3種類型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本22例(占44%)、石蠟切片18例(占36%)和血液標(biāo)本19例(占38%)；用直接測序法檢測50例非小細(xì)胞肺癌患者3種類型標(biāo)本的EGFR基因的突變情況，其陽性檢出率分別為新鮮肺癌組織標(biāo)本13例(占26%)、石蠟切片12例(占24%)和血液標(biāo)本12例(占24%)；DHPLC法檢測結(jié)果與直接測序法一致，ARMS技術(shù)檢出率明顯高于DHPLC法，兩組新鮮肺癌組織標(biāo)本的檢出率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=4.46，P=0.035)，石蠟切片標(biāo)本的檢出率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=1.71，P=0.19), 血液標(biāo)本的檢出率差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=3.05，P=0.05)。ARMS技術(shù)中3種類型標(biāo)本的檢出率相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(c2=0.73，P=0.05)。

討 論

表皮生長因子受體對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮著重要的作用[4]。有研究表明[5]，實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)?？赡苁怯捎贓GFR的高表達引起下游信號傳導(dǎo)的增強，也可能是突變型EGFR受體或配體表達的增加導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化都有待進一步證實。

非小細(xì)胞型肺癌生長分裂較慢,擴散轉(zhuǎn)移相對較晚，但75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變使得非小細(xì)胞型肺癌的治療與酪氨酸激酶抑制劑息息相關(guān)，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是目前被普遍接受的用于EGFR 基因突變的NSCLC 患者的靶向治療藥物。關(guān)于EGFR-TKI治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的國內(nèi)外報道也屢見不鮮，因此對于EGFR 基因突變的檢測顯得尤為重要。目前醫(yī)學(xué)實驗室常用的幾種EGFR 基因突變的檢測方法有直接測序法(Direct sequencing)、Sanger雙脫氧鏈終止法 (Sanger測序法)、突變擴增阻滯系統(tǒng)(Amplification refractory mutation system，ARMS技術(shù))、變性高效液相色譜原理(DHPLC技術(shù))、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization ，F(xiàn)ISH)，本研究小組就此進行研究分析，得出以下結(jié)論：ARMS技術(shù)檢測新鮮肺癌組織EGFR基因突變的檢出率明顯高于DHPLC法和直接測序法，而DHPLC法隨與直接測序法檢出率無太大差異，但DHPLC法操作更簡便，成本較低。全血標(biāo)本的DHPLC法檢測非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因可作為初篩檢測，對于無法確認(rèn)的EGFR突變基因可采用ARMS技術(shù)檢測患者的新鮮肺癌組織EGFR基因。

[1] 王孟昭，陳閩江. 表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑對非小細(xì)胞肺癌患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的療效[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2014,37(3):169-171.

[2] 張永奎，竺王玉，何劍營，等. 舟山海島地區(qū)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因19和21外顯子突變與臨床病理特征的關(guān)系[C]. 2012.

[3] 王生海. HSP90α在非小細(xì)胞肺癌中表達與EGFR基因突變在肺腺癌中關(guān)系的研究[D]. 河北醫(yī)科大學(xué),2014.

[4] Huang Z, Wang Y, Nayak PS,etal. Stretch-induced fetal type II cell differentiation is mediated via ErbB-ErbB4 interactions,” e[J]. Journal of Biological Chemistry,2012,287,(22):18091-18102.

[5] Kumar A, Kumar M, Jaiswal R,etal. Presence of Human papilloma virus and EGFR expression does not predict response to Neoadjuvant chemotherapy in oral cancer[J]. World Journal of Surgical Medical & Radiation Oncology,2012,1(20):103-110.

(收稿：2015-06-20)

*山西省衛(wèi)生廳科研課題(201201007)

肺腫瘤 @EGFR基因 基因轉(zhuǎn)變

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.051

△山西省腫瘤醫(yī)院(研究所)藥理研究室

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