許苗苗，王素素，李 輝,2,*，黃宇琳，逯翠梅，蔣劍波

(1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 吉首 416000)

沉淀聚合法制備葛根素印跡微球及其固相萃取葛根粉

許苗苗1，王素素1，李 輝1,2,*，黃宇琳1，逯翠梅1，蔣劍波1

(1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 吉首 416000)

以葛根素為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑沉淀聚合法制備葛根素印跡聚合物微球。用掃描電鏡觀察微球形貌，靜態(tài)吸附法測(cè)試聚合物的吸附行為。探討分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）對(duì)葛根粗提液中葛根素的吸附、解吸附及固相萃取效能。結(jié)果表明，優(yōu)化的葛根素MIP3對(duì)純模板的靜態(tài)吸附量達(dá)37.9 mg/g；對(duì)粗提液中目標(biāo)化合物的吸附率為（96.3±1.81）%，以水、甲醇-醋酸（9∶1，V/V）及50%甲醇溶液為洗脫劑的單次解吸率為27%～34%，用水從MIP3上解吸出的總?cè)芤航?jīng)脫除溶劑后，所獲粗品葛根素含量最高，達(dá)（37.4±2.87）%。在優(yōu)化條件下，通過(guò)MIP3固相萃取葛根粗提液，葛根素回收率達(dá)71.6%，產(chǎn)品純度高于75%。

分子印跡聚合物；葛根素；沉淀聚合法；吸附；固相萃取

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是在目標(biāo)分子存在下，通過(guò)交聯(lián)聚合制備而成的對(duì)目標(biāo)化合物具有記憶功能的高分子材料[1]。因其基體中含有與目標(biāo)分子在大小、空間結(jié)構(gòu)及化學(xué)基團(tuán)等方面相匹配的結(jié)合孔穴，而對(duì)特定化合物具有選擇識(shí)別能力[2]。分子印跡結(jié)合位點(diǎn)與模板分子間高選擇、可逆、較高容量地相互作用，賦予印跡材料在分離分析及復(fù)雜樣品選擇萃取方面的巨大優(yōu)越性[3-4]。迄今，MIPs已經(jīng)廣泛應(yīng)用在色譜分離分析、仿生傳感、固相萃取、抗體模擬和催化等領(lǐng)域[5-10]。葛根素是可食用植物材料葛根中的一種生物活性化合物[11]，有增加腦血流、提高免疫力、改善記憶、抗腫瘤、降血糖及解酒等藥食兼?zhèn)涔π12-14]。近年來(lái)，葛根素注射液在臨床上被廣泛應(yīng)用。葛根素主要從葛根中提取分離得到，然而，葛根提取液中由于存在大量結(jié)構(gòu)與葛根素相似的化合物，其中主要有大豆苷、大豆苷元、大豆苷元-4,7-二葡萄糖苷。一些常規(guī)分離純化技術(shù)，包括大孔吸附樹(shù)脂法、β-環(huán)糊精鍵合固定相法、絡(luò)合萃取技術(shù)、離子交換纖維法和聚酰胺柱層析吸附法等[15-20]被用于對(duì)葛根素進(jìn)行分離和純化，雖然獲得的葛根素純度較高，但由于分離材料對(duì)目標(biāo)化合物的選擇性差，致使操作步驟繁瑣，溶劑消耗量大，效率較低[21-23]。研究和開(kāi)發(fā)對(duì)葛根素具有高選擇識(shí)別作用的分離材料對(duì)于高效分離和純化此化合物具有重要意義。葛根素印跡聚合物是以目標(biāo)產(chǎn)物葛根素為模板制備的印跡材料，其中印跡位點(diǎn)與模板分子的匹配性顯示了該種材料在分離純化方面的應(yīng)用前景[24]。王琳等[25]制備的葛根素印跡聚合物電化學(xué)傳感器對(duì)模板分子顯示了高度的選擇性和良好敏感度，程邵玲等[26]探究了葛根素印跡聚合物的結(jié)合位點(diǎn)特征并用于提取葛根異黃酮。

本實(shí)驗(yàn)以葛根素為模板分子，采用沉淀聚合法制備了葛根素印跡聚合物微球，考察了MIPs對(duì)純模板的吸附容量及對(duì)葛根粗提液中葛根素的吸附能力，并對(duì)吸附有葛根素的聚合物使用不同洗脫劑進(jìn)行解吸附，探討分子印跡固相萃取葛根粗提液中葛根素的提取和分離純化效能。實(shí)驗(yàn)通過(guò)純化，獲得了純度高于75%的葛根素產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葛根從湖南省吉首農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)購(gòu)買。葛根洗滌干凈，自然風(fēng)干后粉碎。為制備葛根粗提液，稱取葛根粉10 g，加入40 mL乙醇，回流提取2 h，過(guò)濾，固體再用相同體積的乙醇提取2 次，過(guò)濾后合并提取液，即得葛根粗提液。

葛根素（純度高于98%，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA）、α-甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA） 美國(guó)Sigma公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、偶氮二異丁腈（α,α’-azoisobutyronitrile，AIBN）、乙腈、丙酮、甲醇、乙酸 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。所有試劑均為分析純。

LC-20A型高效液相色譜 日本島津公司；KQ-250E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器 浙江樂(lè)清市樂(lè)成電器廠；FA2104N型電子分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；S-3400N型掃描電鏡 河南貝爾偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MIPs的制備和表征

1.3.1.1 沉淀聚合法制備MIPs

使用沉淀聚合法制備MIPs時(shí)，準(zhǔn)確稱取41.6 mg葛根素（模板）于20 mL圓底燒瓶中，加入10.0 mL乙腈和1.0 mL DMSO，加入功能單體MAA和交聯(lián)劑EGDMA，再加入12 mg引發(fā)劑AIBN，超聲處理2 min，通氬氣除氧15 min后。設(shè)置燒瓶轉(zhuǎn)速10 r/min，于60 ℃水浴中反應(yīng)20 h。將反應(yīng)所得固體顆粒用20 mL丙酮沉降4 次，以除去細(xì)小粒子。過(guò)濾，干燥得葛根素印跡聚合物。聚合物產(chǎn)率為聚合物質(zhì)量與加入的單體（模板、功能單體、交聯(lián)劑）總質(zhì)量之比。非印跡聚合物的合成方法與印跡聚合物合成方法一致，但在合成時(shí)不加入模板分子。

1.3.1.2 掃描電鏡分析

取少量分子印跡及非印跡聚合物樣品于1.5 mL無(wú)菌離心管，分別加入一定量甲醇密封，于超聲波清洗器中超聲5 min，各取一滴置于蓋玻片上，待甲醇揮發(fā)后制樣，用S-3400N型掃描電鏡觀看聚合物顆粒大小。

1.3.1.3 MIPs的靜態(tài)吸附

稱取10.0 mg MIPs，加入到5.0 mL質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL葛根素-乙腈溶液中，靜態(tài)吸附4 h后，過(guò)濾，濾液中葛根素質(zhì)量濃度用高效液相色譜分析，并計(jì)算吸附量。其他聚合物的靜態(tài)吸附按同樣的方法進(jìn)行。聚合物的靜態(tài)吸附量Q（mg/g）按式（1）計(jì)算:

式中:ρ0為初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρe為平衡質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為溶液體積/mL；m為聚合物質(zhì)量/g。

1.3.2 吸附與解吸

1.3.2.1 吸附

分別稱取各種聚合物0.5 g于三角瓶中，加入10 mL葛根粗提液，室溫振蕩吸附4 h后，過(guò)濾，高效液相色譜法測(cè)定濾液中葛根素含量，按式（2）計(jì)算吸附率（A）。

式中:ρ0和ρ分別為粗提液和吸附后濾液中的葛根素質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2.2 解吸附

將吸附有葛根素的聚合物，分別用乙腈、水、甲醇-醋酸（9∶1，V/V）、50%甲醇溶液為洗脫劑進(jìn)行解吸附。將1.3.1節(jié)步驟中吸附有葛根素的聚合物過(guò)濾，于60 ℃真空干燥，稱取各種固體0.2 g，分別加入到5.0 mL洗脫劑中，室溫振蕩解吸2 h后，過(guò)濾，高效液相色譜測(cè)定濾液中葛根素質(zhì)量濃度。按式（3）計(jì)算葛根素解吸率（D）。

式中:ρ’為解吸液中葛根素質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為解吸液體積/mL；m’為初始質(zhì)量/g。

1.3.3 分子印跡固相萃取

稱取0.5 g葛根素印跡聚合物（MIP3），裝填到5.0 mL的固相萃取器中，出口端連接真空泵。將2.0 mL葛根粗提液上樣后，開(kāi)啟真空泵，收集流出液。先用2.0 mL乙腈洗脫非選擇性吸附，再用9×2.0 mL水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集每次的洗脫液，各洗脫液中葛根素含量用高效液相色譜分析。

1.3.4 高效液相色譜分析

高效液相色譜法分析葛根素含量。色譜柱為ODS柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（1∶3，V/V）溶液，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定性定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIPs的制備和表征

改變功能單體及交聯(lián)劑用量，采用沉淀聚合法制備了3 種葛根素印跡聚合物（MIP1～3）及非印跡聚合物（NIP1～3）。由表1可以發(fā)現(xiàn)，隨著功能單體及交聯(lián)劑用量的增加，MIPs及非印跡聚合物的產(chǎn)率增加。當(dāng)2 種單體的用量分別為0.8 mmol和12 mmol時(shí)，MIPs及非印跡聚合物產(chǎn)率分別為55.8%和70.2%。表1也給出了6 種聚合物對(duì)葛根素-乙腈溶液（0.15 mg/mL）的靜態(tài)吸附結(jié)果，顯示MIP3對(duì)模板的吸附量最高。

圖2給出了3 種葛根素印跡及非印跡聚合物的掃描電鏡圖。顯示非印跡聚合物（NIP1～3）均為粒徑約10 μm的均勻微球，而MIPs微球粒徑分散，在5～30 μm范圍變化。沉淀聚合法中，分子印跡微球粒徑的分散性可能是由于模板分子的存在影響沉淀生成而引起的。

2.2 MIPs對(duì)葛根素的吸附及解吸附

圖3示出了6 種聚合物對(duì)葛根粗提液中葛根素的吸附率。結(jié)果表明MIPs對(duì)葛根素的吸附率明顯高于非印跡聚合物，其中MIP3對(duì)葛根素的吸附率最高，為（96.3±1.81）%。印跡聚合物對(duì)目標(biāo)物強(qiáng)的吸附能力是由于MIPs基體中除了具有與模板分子在大小、空間結(jié)構(gòu)及化學(xué)基團(tuán)相匹配的高選擇識(shí)別位點(diǎn)，還有大量非選擇性結(jié)合位點(diǎn)，而非印跡聚合物僅有非選擇性識(shí)別位點(diǎn)。

將吸附有葛根素的聚合物過(guò)濾，然后分別用乙腈、水、甲醇-醋酸（9∶1，V/V）、50%甲醇溶液為洗脫劑進(jìn)行解吸附，解吸2 h后，各種聚合物上葛根素的解吸率見(jiàn)表2。可以發(fā)現(xiàn)，葛根素在非印跡聚合物上的解吸率高于相應(yīng)的印跡聚合物，這是由于非印跡聚合物對(duì)葛根素的結(jié)合強(qiáng)度要比印跡聚合物弱的原故。對(duì)于MIPs上的解吸附而言，除了用乙腈解吸效果稍差之外，用水、甲醇-醋酸（9∶1，V/V）及50%甲醇溶液為洗脫劑解吸效果相差不大，解吸率在27%～34%范圍內(nèi)變化，這是因?yàn)樗鼈兙鶠橘|(zhì)子洗脫劑，容易破壞模板分子與印跡位點(diǎn)的氫鍵作用而解吸目標(biāo)化合物。

將各種聚合物上使用不同洗脫劑解吸后的溶液過(guò)濾，濾液減壓蒸餾脫除溶劑后，得葛根素粗品。再用少量甲醇分別溶解這些葛根素粗品，用高效液相色譜測(cè)定粗品中葛根素含量，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。可以發(fā)現(xiàn)，雖然印跡聚合物的靜態(tài)解吸率低于非印跡聚合物（表2），但從MIPs中萃取出的粗品中葛根素含量明顯高于從非印跡聚合物中萃取的粗品。特別是從吸附有葛根素的MIP3上，以水為洗脫劑萃取出的葛根素粗品純度最高，達(dá)（37.4±2.87）%。印跡聚合物解吸產(chǎn)物純度高，主要是由于目標(biāo)產(chǎn)物在MIPs柱上能被選擇性洗脫，而在非印跡柱上，使用洗脫劑洗脫時(shí)不能選擇性脫附目標(biāo)物。通過(guò)研究聚合物的吸附與解吸附，發(fā)現(xiàn)MIP3作為吸附材料，以水為洗脫劑，吸附和分離葛根粗提液中的葛根素具有較好效果。

2.3 MIPs固相萃取分離和純化葛根素

以MIP3為固相萃取吸附劑，以水為洗脫劑進(jìn)行萃取和分離葛根粗提液中的葛根素。為此，在含有0.5 g MIP3聚合物的固相萃取器中，將2.0 mL葛根粗提液上樣后，先用2.0 mL乙腈洗脫非選擇性吸附，再用9×2.0 mL水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集每次的洗脫液。用高效液相色譜分析洗脫液組成。各步洗脫液的色譜圖如圖4所示。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，在第2、3和4步洗脫液中，葛根素（保留時(shí)間為12.7 min）的含量較高，于是，將這3步洗脫液合并，減壓濃縮脫除溶劑，再用1 mL甲醇溶解，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，高效液相色譜分析所獲產(chǎn)品中葛根素含量。結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)產(chǎn)品中葛根素含量高于75%，此3步操作所得葛根素的回收率為71.6%。

3 結(jié) 論

MIPs是一種對(duì)目標(biāo)化合物的分子大小、形狀及化學(xué)基團(tuán)具有記憶功能的高分子材料。本實(shí)驗(yàn)使用不同制備條件獲得了幾種葛根素印跡及其非印跡聚合物微球，考察了這些聚合物對(duì)葛根粗提液中葛根素的吸附和解吸性能，以葛根素含量為指標(biāo)，優(yōu)化解吸附溶劑。在優(yōu)化條件下通過(guò)MIP3單次固相萃取葛根粗提液，葛根素回收率達(dá)71.6%，產(chǎn)品純度高于75%。

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Preparation of Puerarin-Imprinted Polymer Microspheres by Precipitation Polymerization Technique for Use in Solid Phase Extraction of Flavonoids from Pueraria Root Powder

XU Miaomiao1, WANG Susu1, LI Hui1,2,*, HUANG Yulin1, LU Cuimei1, JIANG Jianbo1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China; 2. Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization, Jishou University, Jishou 416000, China)

Puerarin-imprinted polymer microspheres (MIPM) were prepared by precipitation polymerization technique using puerarin, methacrylic acid (MAA) and ethylene glycol dimethylacrylate (EGDMA) as the template, functional monomer and cross-linker, respectively. Scanning electron microscope (SEM) was used for evaluating the morphology of polymer and a static method was used for characterizing the adsorption behavior. The application of the MIPM for adsorption, desorption and solid phase extraction of puerarin from crude pueraria root extract was explored. Results indicated that the adsorption capacity for the optimized MIPM (MIP3) toward the pure template reached 37.9 mg/g, with an adsorption percentage of (96.3 ± 1.81)% toward the target compound in the crude extract. The desorption percentage varied within the range of 27%-34% when water, methanol-acetic acid (9:1, V/V) and 50% aqueous methanol were used as the eluents, respectively. Furthermore, the product desorbed from the MIP3 using water as the eluent contained the highest content of puerarin (37.4 ± 2.87)%. Puerarin product with 75% purity can be obtained by MIP3 using single-step solid phase extraction with a puerarin recovery of 71.6%.

molecularly imprinted polymer; puerarin; precipitation polymerization; adsorption; solid phase extraction

TS202.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510003

2014-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21077042)；湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(2012SK3145)

許苗苗(1987—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)成分分離分析。E-mail：xumiaomiao2011@126.com

*通信作者：李輝(1968—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樯茖W(xué)中的分離分析新方法。E-mail：lihuijsdx@163.com