潘 廣，章桂明，陳枝楠，程穎慧，向才玉，包先雨，凌杏園,*

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科 學(xué)研究院,廣東 深圳 518010)

應(yīng)用LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)大米制品中轉(zhuǎn)基因成分

潘 廣1，章桂明1，陳枝楠2，程穎慧1，向才玉1，包先雨2，凌杏園1,*

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科 學(xué)研究院,廣東 深圳 518010)

大米制品中痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)需要特異和超靈敏的檢測(cè)方法。本研究以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因大米篩查位點(diǎn)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Cry1A基因?yàn)槟繕?biāo)，利用在常規(guī)TaqMan探針中摻入鎖核苷酸提高探針退火溫度和雜交特異性等特點(diǎn)，經(jīng)比較以上位點(diǎn)不同LNA-T aqMan探針實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)效果，建立了針對(duì)上述篩查位點(diǎn)的基于LNA-TaqMan探針的新型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度超高；與普通TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比，其反應(yīng)Ct值可提前1～3個(gè)循環(huán)（Cry1A位點(diǎn)除外），檢測(cè)低限可達(dá)3 pg。該檢測(cè)方法可以用以檢測(cè)大米制品中常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR難以檢測(cè)到的痕量轉(zhuǎn)基因大米成分。

大米制品；鎖核酸；鎖核酸探針；實(shí)時(shí)熒光PCR

大米是我國(guó)最主要的主糧之一，其安全性特別是轉(zhuǎn)基因情況倍受百姓關(guān)注。目前，國(guó)際上有5 個(gè)已批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因水稻品種，它們是拜耳公司研發(fā)的LLRICE06、LLRIC E601和LLRICE62，日本研發(fā)的7Crp#10和伊朗研發(fā)的Tarom molaii+cry1Ab。我國(guó)是最早開(kāi)展轉(zhuǎn)基因水稻研究的主要國(guó)家之一，截至2009年，我國(guó)有記錄的田間試驗(yàn)達(dá)4 000多次，其中水稻有480余次[1]；僅國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已披露的我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻品系就有Bt汕優(yōu)63、華 恢1號(hào)、科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、科螟稻等[2-4]，其中品系Bt汕優(yōu)63和華恢1號(hào)于2010年獲農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的生物安全證書。我國(guó)迄今未批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因大米的進(jìn)口，也未批準(zhǔn)任何國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化種植；因此，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)以及在出口的大米和米制品中不應(yīng)含有任何的轉(zhuǎn)基因成分。然而，僅在2012年，我國(guó)出口到歐盟的大米制品如米粉、米線、米條等被通報(bào)檢出非法轉(zhuǎn)基因成分的就達(dá)到32 次之多[5]。這不僅給出口企業(yè)造成了直接的經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是影響了我國(guó)出口產(chǎn)品的聲譽(yù)。

出現(xiàn)上述情況，一是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因品種或品系資源在環(huán)境釋放等環(huán)節(jié)存在監(jiān)管上的漏洞；其二是我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻未商業(yè)化種植，出現(xiàn)在普通大米中的轉(zhuǎn)基因大米往往是污染造成的，本身含量就很低，加上米制品在加工生產(chǎn)過(guò)程中，其基因組DNA高度降解，以目前常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR為主的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法往往難以檢出這些痕量的轉(zhuǎn)基因成分。因此，有必要研發(fā)專門針對(duì)米制品等加工食品的痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)，以確保對(duì)這些大米制品中的轉(zhuǎn)基因成分“檢得出”和“檢的準(zhǔn)”。

L AN-TaqTan探針是一種應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光PCR的新型的探針。由于其在常規(guī)TaqMan探針中參入了鎖核苷酸（locked nucleotide acid，LAN），大大提高探針與目標(biāo)序列的親和力，提高了探針的Tm值，從而可使探針設(shè)計(jì)的更短，進(jìn)而適應(yīng)于超短DNA片段的檢測(cè)，因此檢測(cè)靈敏度更高[6]。本研究以米制品為材料，以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中篩查轉(zhuǎn)基因大米成分的CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Cry1A基因?yàn)槟繕?biāo)[7]，設(shè)計(jì)和制備了摻入不等鎖核苷酸的超短的LNA-TaqMan探針。通過(guò)對(duì)不同的LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果比較，篩選得到了檢測(cè)上述3 個(gè)外源基因的LNA-TaqMan短探針，進(jìn)而建立了針對(duì)上述篩查基因的LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，特別適于大米制品等加工食品中含上述外源基因的轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

爆米花、旺旺大米餅、旺旺黑米雪餅、旺旺大米海苔、貝殼米粉、東莞米粉、河源米粉、桂林米粉、江西米粉和云南米線均采自超市。

轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品Bt11 歐盟標(biāo)準(zhǔn)局；轉(zhuǎn)基因大米標(biāo)準(zhǔn)品LLRice62、LLRice601 美國(guó)美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)；轉(zhuǎn)基因水稻（大米）科豐8號(hào)、科豐6號(hào)和Bt汕優(yōu)63參照樣品由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；大米制品米粉1、2和3號(hào)、東北五常大米、泰國(guó)香米及非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因小麥均由本實(shí)驗(yàn)室收集。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)用試劑盒TaqMan Enviromental Master Mix 2.0 美國(guó)Applied Biosystems公司。CTAB核酸提取液和沉淀液等均由實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；渦旋震蕩儀 德國(guó)IKA公司；恒溫水浴鍋 北京六一公司；NanoDrop2000c分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystem公司；純水器 美國(guó)Millipore純水器。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與制備

DNA提取方法采用GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè):核酸提取純化方法》中的CTAB-2方法[8]，用NanoDrop2000c測(cè)定其濃度和質(zhì)量。DNA質(zhì)量濃度按照下式計(jì)算:

C=A×N×50

式中:C為DNA質(zhì)量濃度/（ng/μL）；A為260 nm波長(zhǎng)處的吸光度；N為核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)A260nm/A280nm比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 LNA-TaqMan探針和引物

引物序列、LNA-TaqMan探針序列以及鎖核苷酸摻入位置見(jiàn)表1，以上探針和引物均由江蘇碩世生物科技有限公司合成。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，其中2× TaqMan Enviromental Mix 2.0 10 μL，DNA模板（50 ng/μL）3 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，用雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μL，每個(gè)試樣重復(fù)3 次PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7900型實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)采用兩步法:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)特異性測(cè)定

用2% Bt11、10%科豐6號(hào)、100%科豐8號(hào)、100%克螟稻、5%Bt汕優(yōu)63、LLRice62、LLRice601、東北大米、泰國(guó)香米以及非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因小麥共總計(jì)14 個(gè)不同轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因樣品測(cè)試方法的特異性。

1.3.5 檢測(cè)低限的測(cè)定

將100%科豐8號(hào)轉(zhuǎn)基因大米基因組DNA，用10 倍梯度系列稀釋成10 ng/μL～0.1 pg/μL共6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，每PCR反應(yīng)加3 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次PCR反應(yīng)。發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的最低樣品質(zhì)量濃度或基因組DNA量即該方法的檢測(cè)低限。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)效率測(cè)定

按檢測(cè)低限測(cè)定方法配制標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品，以樣品擴(kuò)增的Ct值為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品DNA拷貝數(shù)（或濃度）的對(duì)數(shù)為X軸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品的Ct值和基因組DNA拷貝數(shù)（或濃度）的對(duì)數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Ct=k×lg（DNA拷貝數(shù)）+b），計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性斜率k值。根據(jù)公式E=10-1/k-1計(jì)算定量PCR的擴(kuò)增效率。

1.3.7 實(shí)際樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

用所建立的LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法和普通TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)對(duì)13 份米制品進(jìn)行檢測(cè)，每檢測(cè)位點(diǎn)重復(fù)3 次檢測(cè)。兩者除了探針引物不同之外，其他其他反應(yīng)體系、DNA用量和反應(yīng)條件完成一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2584—2010《水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》[8]規(guī)定了篩查轉(zhuǎn)基因水稻成分外源基因CaMV35S、NOS和Cry1A的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本研究以上述3 種基因標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)目標(biāo)區(qū)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)摻入鎖核苷酸的LNA-TaqMan的短探針和引物。由于摻入鎖核苷酸的數(shù)目和位置直接影響探針的長(zhǎng)短和實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的效果，本研究以100%科豐8號(hào)樣品DNA為材料，將這些設(shè)計(jì)制備的鎖核酸探針（包括相配套的引物）的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在同等條件下與標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2584—2010規(guī)定的實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)進(jìn)行比較，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)Ct值提前最多（或大）同時(shí)鎖核酸探針最短的原則，最終確定了檢測(cè)CaMV35S、NOS和Cry1A位點(diǎn)的鎖核酸探針和引物序列（表1）。上述三位點(diǎn)中CaMV35S和NOS的基于鎖核酸探針的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在不同DNA濃度時(shí)Ct值比相應(yīng)普通探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法均提前1～3個(gè)循環(huán)（表2）；位點(diǎn)Cry1A不同濃度檢測(cè)Ct值提高沒(méi)有規(guī)律，但設(shè)計(jì)的探針比普通TaqMan探針大大縮短。以上結(jié)果表明這種基于LNA-TaqMan探針檢測(cè)方法的靈敏度有了很大地提高。

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，CaMV35S基因在KF6、Bt11、KF8、KMD1、LLRice6和LLRice601等轉(zhuǎn)基因樣品中實(shí)際存在[4,9-13]，而本實(shí)驗(yàn)的特異性檢測(cè)結(jié)果與其一致；NOS基因和Cry1A基因也得到了相同的結(jié)果；同時(shí)上述3 個(gè)基因均沒(méi)有在泰國(guó)香米、東北大米和其他非轉(zhuǎn)基因植物中檢出。以上結(jié)果表明本研究建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

2.3 檢測(cè)低限測(cè)定結(jié)果

以100%科豐8號(hào)樣品DNA通過(guò)梯度稀釋獲得的30、3 ng，300、30、3 pg和0.3 pg的總DNA模板量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)DNA樣品重復(fù)3 次。表4顯示，對(duì)于300 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來(lái)說(shuō)，3 個(gè)篩查基因均得到有效擴(kuò)增，且其Ct值均小于35，且不同重復(fù)間曲線重合性較好（圖1～3）。對(duì)于30 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來(lái)說(shuō)，CaMV35S基因只有一個(gè)出現(xiàn)擴(kuò)增，且Ct值已超過(guò)37（圖1未給出擴(kuò)增曲線），表明其檢測(cè)低限低于300 pg；但NOS基因和Cry1A基因兩者均可以檢出，且Ct值在30左右，且重復(fù)性較好（圖2和圖3），可見(jiàn)該兩基因的檢測(cè)方法的靈敏度優(yōu)于CaMV35S。對(duì)于3 pg和0.3 pg的轉(zhuǎn)基因含量100%的DNA樣品來(lái)說(shuō)，NOS基因和Cry1A基因兩者均有擴(kuò)增，NOS基因擴(kuò)增重復(fù)性較好（圖2），Ct值在37左右；Cry1A基因在3 次重復(fù)中只擴(kuò)增出1 次，Ct值已在37左右，可見(jiàn)0.3 pg基因組DNA（100%轉(zhuǎn)基因含量）是兩基因的檢測(cè)低限。另外，計(jì)算擴(kuò)增效率顯示，CaMV35S、NOS和Cry1A基因的擴(kuò)增效率分別為120%、105%和105%。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

用建立的LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法和普通TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)對(duì)13份米制品進(jìn)行檢測(cè)，每位點(diǎn)重復(fù)3 次檢測(cè)，Ct值取其平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，13 個(gè)米制品中提取的基因組DNA質(zhì)量很好，沒(méi)有抑制PCR擴(kuò)增的物質(zhì)存在，因?yàn)閮?nèi)源基因Gos9擴(kuò)增效果好；3 種旺旺米制品和爆米花內(nèi)源基因Gos9擴(kuò)增Ct值高，表明大米制品DNA的降解比另外9 種米粉和米線產(chǎn)品程度大。從2 種方法外源基因的擴(kuò)增Ct值可以看出，2號(hào)、3號(hào)、東莞、河源、桂林和江西米粉6個(gè)樣品2 種實(shí)時(shí)熒光PCR均有擴(kuò)增信號(hào)，其Ct值在33.12～38.89之間，表明它們含轉(zhuǎn)基因成分，但含量低，是典型的弱陽(yáng)性樣品。旺旺大米餅2 種探針檢測(cè)均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，表明該大米制品不含轉(zhuǎn)基因大米成分。而對(duì)于其他6 種大米制品兩種方法檢測(cè)的結(jié)論不同，普通TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，而本研究建立的方法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，因?yàn)镃aMV35S基因檢測(cè)呈陽(yáng)性。從表5還可以看出，位點(diǎn)CaMV35S和NOS位點(diǎn)鎖核酸探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Ct值比普通實(shí)時(shí)熒光PCR方法均提前1～3各循環(huán)；對(duì)于位點(diǎn)Cry1A，含LNA探針實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)Ct值也均有提前，但對(duì)樣品桂林米粉和江西米粉Ct值提前不到1 個(gè)循環(huán)（表5中帶“*”的Ct值）?？梢?jiàn)本新方法的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用的普通探針實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法。這是因?yàn)殒i核酸探針與靶序列DNA結(jié)合穩(wěn)定性高、熒光信號(hào)強(qiáng)、嘈音低，熒光信號(hào)更易為PCR儀檢出；另外，由于鎖核酸探針比普通探針短很多（表1），對(duì)于DNA高度降解的加工食品，其有效模板數(shù)相對(duì)增加了。

3 討 論

目前，針對(duì)大米制品等加工食品低痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法，主要有TaqMan或SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR和巢式PCR等分子檢測(cè)方法[9,14-16]，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01%（質(zhì)量百分比）。但這些PCR方法的檢測(cè)目標(biāo)DNA一般在100 bp以上，由于加工食品中DNA遭到高度降解，許多DNA片段小于以上長(zhǎng)度，因而進(jìn)一步降低加工食品中PCR反應(yīng)有效的起始模板數(shù)，致使這些方法的實(shí)際檢測(cè)靈敏度大大降低。而巢式PCR還存在易污染、假陰性等現(xiàn)象。因此，對(duì)加工食品高度降解后短片斷DNA的檢測(cè)，是提高檢測(cè)靈敏度高的關(guān)鍵。

LNAs是核酸的類似物，其與普通寡核苷酸類似物相比在其碳環(huán)的2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結(jié)構(gòu)，由于LNA與DNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架，其不但可以與DNA、RNA結(jié)合成雙鏈，且其雙鏈的熱穩(wěn)定性更高。據(jù)研究在普通探針中引入一個(gè)LNA堿基可增強(qiáng)探針和底物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高探針Tm（退火溫度）3～8 ℃并使TaqMan探針信號(hào)增強(qiáng)、信噪比增大[17-18]。因此，相同長(zhǎng)度的含LNA的雜交探針比普通雜交探針與目標(biāo)序列的雜交特異性更高，目前含LNA雜交探針的這一特點(diǎn)已應(yīng)用于如芯片、原位雜交等分子生物學(xué)領(lǐng)域[19]。同理，在相同解鏈溫度條件下，LNATaqMan探針比普通TaqMan探針短。LNA-TaqMan探針可以設(shè)計(jì)較得更短的這一特點(diǎn)已應(yīng)用于檢測(cè)復(fù)雜目標(biāo)序列，如AT或GC富含區(qū)。Tranh等[20]應(yīng)用LNA-TaqMan探針RT-PCR檢測(cè)H5N1流感病毒，并指出LNA探針因其檢測(cè)的高效率性而與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合用于臨床疾病檢測(cè)。韋信賢等[21]應(yīng)用LNA-TaqMan探針熒光定量PCR快速檢測(cè)對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，證明該方法檢測(cè)IHHNV的靈敏度高，可以檢測(cè)到約10 個(gè)病毒粒子/反應(yīng)，且特異性、重復(fù)性和重現(xiàn)性較好。

LNA-TaqMan探針比常規(guī)TaqMan探針可設(shè)計(jì)得更短，可以適于加工食品中降解DNA的檢測(cè)，然而這一特點(diǎn)迄今未用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較分析轉(zhuǎn)基因大米常見(jiàn)品系的分子特征，選擇覆蓋面廣的CaMV35S、NOS和Cry1A基因作為篩查基因，并針對(duì)這3 個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了鎖核酸檢測(cè)引物和探針，使檢測(cè)的目標(biāo)序列比普通實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)目標(biāo)區(qū)大大縮短。這些位點(diǎn)的基于LNATaqMan探針的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度非常高，檢測(cè)低限可以達(dá)到0.3 pg，根據(jù)理論推算，一個(gè)單倍體水稻基因組的大小為0.47 pg[4]，該方法等同于能檢測(cè)到1 個(gè)拷貝左右的目的基因。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明所建立的方法具有較好的穩(wěn)定性，在不同重復(fù)間曲線擬合性較好。在對(duì)實(shí)際轉(zhuǎn)基因米粉樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出米制品中的痕量轉(zhuǎn)基因成分。該方法與普通TaqMan探針?lè)ㄏ啾炔粌H檢測(cè)靈敏度較高、重現(xiàn)性好，而且Ct值明顯提高。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求，如實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Ct值大于36，須重新對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。LNA-TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Ct值提前這一特點(diǎn)，利于弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)Ct值降到36以下，從而利于結(jié)果的判斷，避免重新檢測(cè)樣品，節(jié)約了檢測(cè)成本。

本研究應(yīng)用LNA-TaqMan探針解決了米制品等食品中含位點(diǎn)CaMV35S、NOS和Cry1A痕量轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)難題。其他轉(zhuǎn)基因篩查位點(diǎn)的檢測(cè)同樣可以采用LNATaqMan探針，來(lái)建立超靈敏和高特異性檢測(cè)方法。轉(zhuǎn)基因品系檢測(cè)比轉(zhuǎn)基因篩查更能區(qū)分產(chǎn)品中批準(zhǔn)和未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分，今后采用本研究方法研究建立以轉(zhuǎn)基因品系邊界序列為目標(biāo)的基于LNA-TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法意義更為重要。

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Ultra-Sensitive Detection of Genetically Modified Ingredients in Rice-Derived Products Using Real-Time PCR with Locked Nucleic Acid TaqMan Probe

PAN Guang1, ZHANG Guiming1, CHEN Zhinan2, CHENG Yinghui1, XIANG Caiyu1, BAO Xianyu2, LING Xingyuan1,*
(1. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 2. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518010, China)

This study aimed to establish a specific and ultra-sensitive detection method for trace genetically modified (GMO) ingredients in rice-derived products. In this study, the CaMV35S promoter, NOS terminator and Cry1A gene included in the industrial standard for screening the GM components of rice were selected as the targets. By substituting a few nucleotides of the TaqMan probe with locked nucleic acid (LNA) nucleotide and comparing the performances of these LNA-TaqMan probes in real-time PCR (RT-qPCR), a novel real-time PCR method based on LNA-TaqMan probe for the above genes and gene elements was established with high specificity. Compared to the conventional RT-PCR with TaqMan probe, this RTPCR with LAN-Taqman probe was much more sensitive, ha d lower limit of detection (LOD) (0.001% by mass) and 1-3 less Ct value cycles except for Cry1A. This reported new PCR method can be applied for the detection of trace GM components in rice-derived products that could not be detected with the conventional RT-PCR probe.

rice-de rived products; locked nucleic acid (LNA); LNA-TaqMan probe; real-time PCR

S511

A

10.7506/spkx1002-6630-201510042

2014-07-24

深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(JC201105190969A)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng) (2014ZX08012-001)

潘廣(1985—),男,農(nóng)藝師,碩士,研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。E-mail：pg0101@126.com

*通信作者：凌杏園(1964—),男,高級(jí)農(nóng)藝師,博士,研究方向?yàn)橹参锘蚬こ毯头肿由飳W(xué)。E-mail：lxy6421@qq.com