張明如，饒 麗，王建光，結(jié) 莉，丁洪流，沈曉芳,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,江蘇 蘇州 215104)

實(shí)時(shí)熒光HDA法快速檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌

張明如1，饒 麗1，王建光1，結(jié) 莉2，丁洪流2，沈曉芳1,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,江蘇 蘇州 215104)

目的:建立一種用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的實(shí)時(shí)熒光賴解旋酶恒溫核酸擴(kuò)增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）快速檢測方法。方法:針對單核細(xì)胞增生李斯特菌hly基因序列設(shè)計(jì)引物對，基于熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀的平臺(tái)，提取單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA，以此作為模板，優(yōu)化反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及引物濃度。利用單核細(xì)胞增生李斯特菌及10 株對照菌株，并與實(shí)時(shí)熒光PCR對比，來驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光HDA方法的特異性和靈敏度，并初步用于樣品檢測。結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光HDA體系的最適引物濃度為0.075 μmol/L，反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間為65 ℃、80 min（40 個(gè)循環(huán)），具有良好的特異性和靈敏度。結(jié)論:建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光HDA檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法。

單核細(xì)胞增生李斯菌；hly基因；賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光HDA；快速檢測

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種革蘭氏陽性短小無芽胞桿菌[1-2]。李斯特菌屬有2 個(gè)群共7 個(gè)種[3]，其中單核細(xì)胞增生李斯特菌是能引起人類疾病的一種重要的食源性致病菌。單增李斯特菌在自然界分布廣泛，蔬菜、乳制品、海產(chǎn)品、肉類和禽類等食品都已被證實(shí)是其傳播的載體[4]，該菌的易感人群主要是孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者，感染后主要會(huì)引起李斯特菌病、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等，致死率高達(dá)20%～50%[5-7]。2000年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）已將單增李斯特菌列為重點(diǎn)檢控的食源性致病菌之一[8-9]。

賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）是由美國NEB公司研究人員Vincent等于2004年發(fā)明的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10-11]，該技術(shù)模擬體內(nèi)DNA在恒溫條件下進(jìn)行復(fù)制的自然過程，在恒溫條件下利用生物復(fù)制系統(tǒng)的關(guān)鍵組分實(shí)現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。HDA主要是利用解旋酶在恒溫條件下解開DNA雙鏈，同時(shí)DNA單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定解開的單鏈為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶序列的指數(shù)式增長[12-17]。HDA技術(shù)與傳統(tǒng)PCR的區(qū)別主要在于HDA通過添加解旋酶及單鏈結(jié)合蛋白在等溫條件下實(shí)現(xiàn)單鏈模板的循環(huán)生產(chǎn)，克服了傳統(tǒng)PCR需要依靠儀器反復(fù)升降溫來獲取單鏈模板的缺點(diǎn)。目前這種方法已應(yīng)用于一些病原菌的檢測[18-21]。單增菌的致病性與多種毒力因子有關(guān)，其中溶血素O在單增菌侵染過程中扮演著重要角色，是單增菌的主要毒力因子，它存在于所有的致病性單增菌中，是能夠結(jié)合膽固醇，并且可被巰基活化的細(xì)胞溶解素[22-25]。溶血素O是由hly基因編碼而來的，本研究嘗試選取hly基因作為檢測靶基因，自行設(shè)計(jì)特異性引物，建立實(shí)時(shí)熒光HDA快速檢測單增李斯特菌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的單核細(xì)胞增生李斯特菌株和實(shí)驗(yàn)菌株如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)菌株分別購自美國典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）和中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）。

HDA等溫?cái)U(kuò)增試劑盒（IsoAmpⅡ tHDA kit） 美國New England Biolabs（NEB）公司；7500熒光定量PCR儀美國ABI公司；Maxima SYBR Green qPCR預(yù)混液 美國Thermo Fisher Scientific公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)單增李斯特菌ATCC19115在GenBank中hly基因的登錄號JN703919.1，應(yīng)用BatchPrimer3設(shè)計(jì)多對引物，分別篩選出適合實(shí)時(shí)熒光HDA和實(shí)時(shí)熒光PCR的引物對見表2，引物由生工生物工程（上海)股份有限公司合成。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

分別通過試劑盒法和熱裂解法提取各菌株基因組DNA，并用Epoch微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行DNA檢測，結(jié)果表明2 種方法提取到的DNA差異不大，因此選擇熱裂解法提取各菌株的DNA。試劑盒法提取步驟詳見試劑盒說明書，熱裂解法提取步驟:取1 mL菌懸液于EP管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；取500 μL滅菌水吹打沉淀，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；重復(fù)上一步驟；取100 μL滅菌水吹打沉淀，沸水浴10 min，12 000 r/min離心1 min；取上清液至另一EP管，-20 ℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光HDA方法的建立

熱裂解法提取菌株DNA，按HDA等溫?cái)U(kuò)增試劑盒建立反應(yīng)體系，并對引物終濃度、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。按照優(yōu)化后的方法對各菌株提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光HDA擴(kuò)增，驗(yàn)證方法的可行性。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增方法參照反應(yīng)試劑盒說明書，在7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.2.4 引物特異性實(shí)驗(yàn)

以單增李斯特菌株及對照菌株提取的DNA為模板，分別采用實(shí)時(shí)熒光HDA和實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證各自引物的特異性。

1.2.5 單增李斯特菌純培養(yǎng)靈敏度實(shí)驗(yàn)

將單增李斯特標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115活化，接種至適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并用濁度儀檢測其菌懸液濃度（1.2×108CFU/mL），將菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，用熱裂解法提取各梯度單增李斯特菌基因組DNA，以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光HDA和PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其檢測靈敏度。

1.2.6 人工污染鮮肉中單增李斯特菌最低檢測限實(shí)驗(yàn)

對實(shí)驗(yàn)中用到的新鮮牛肉用國標(biāo)的方法進(jìn)行檢測，證明不含單增李斯特菌。將增菌培養(yǎng)的單增李斯特菌菌懸液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，對應(yīng)的人工污染到牛肉中，具體操作:將市售牛肉進(jìn)行攪拌，加少些生理鹽水進(jìn)行均質(zhì)，稱取30 g樣品加入到270 mL生理鹽水中，混合均勻并分成10份，每等份29 mL，進(jìn)行滅菌。把稀釋好的單增李斯特菌對應(yīng)的污染到肉勻漿液中。用熱裂解法提取各梯度污染的肉勻漿DNA，以此作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光HDA和PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其最低檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立及優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光HDA反應(yīng)體系（25 μL）:dd H2O 12.5 μL，10×Annealing buffer 2.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1 μL，NaCl（500 mmol/L） 2 μL，IsoAmp dNTP Solution 1.75 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μmol/L） 0.375 μL，Reverse Primer（5 μmol/L） 0.375 μL，DNA 2 μL，IsoAmp Enzyme Mix 1.75 μL，EvaGreen（20×，Biotium）0.25 μL，ROX Reference Dye（50×，Invitrogen）0.5 μL。體系的最適引物濃度為0.075 μmol/L。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系（25 μL）:dd H2O 7.45 μL，qPCR Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μmol）1.5 μL，Reverse Primer（5 μmol） 1.5 μL，DNA 2 μL，ROX 0.05 μL（使用前按說明書稀釋）。

反應(yīng)程序見表3。

2.2 引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于引物設(shè)計(jì)參數(shù)的不同，HDA反應(yīng)和PCR的最適引物有所不同。所以本實(shí)驗(yàn)分別針對HDA和PCR方法設(shè)計(jì)各自最適引物（表2），各自的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光HDA和PCR對單增李斯特菌都有較好的特異性，但從曲線可以看出，HDA方法可在較短時(shí)間內(nèi)快速達(dá)到穩(wěn)定期，擴(kuò)增效率較高。

2.3 單增李斯特菌純培養(yǎng)靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將菌懸液濃度1.2×108CFU/mL的單增李斯特菌進(jìn)行10 倍梯度稀釋，提取每個(gè)稀釋度的菌懸液DNA，分別用HDA及PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，比較兩種方法的檢測靈敏度，由圖2可以看出，單增李斯特菌純培養(yǎng)HDA方法的最低檢測限是1.2×102CFU/mL，PCR方法的最低檢測限是1.2×103CFU/mL，所以實(shí)時(shí)熒光HDA的檢測靈敏度要微高于實(shí)時(shí)熒光PCR，且更易達(dá)到穩(wěn)定期。

2.4 人工污染鮮肉中單增李斯特菌最低檢測限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將經(jīng)過增菌純培養(yǎng)的單增李斯特菌懸液10 倍梯度稀釋后對應(yīng)的人工污染到滅菌后的牛肉勻漿液中，經(jīng)計(jì)算可知人工污染樣品的菌懸液濃度是1.2×107～1.2×10-2CFU/mL，熱裂解法分別提取污染樣品的DNA，以此作為模板進(jìn)行HDA和PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證兩種方法的最低檢測限，由圖3的擴(kuò)增曲線可知，HDA和PCR可以檢測到的最低單增李斯特菌濃度是一樣的，都是1.2×104CFU/mL。說明實(shí)時(shí)熒光HDA和實(shí)時(shí)熒光PCR的樣品最低檢測限相當(dāng)。

2.5 樣品檢測驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用實(shí)時(shí)熒光HDA方法對90 份送檢食品、市售食品和人工污染食品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示。其中有3 份單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性樣品，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR和國標(biāo)法GB 4789.30—2010 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn):單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)》復(fù)檢，檢測結(jié)果一致，由此可知，實(shí)時(shí)熒光HDA檢測方法具有良好的特異性和靈敏度。

3 討 論

單核細(xì)胞增生李斯特菌是全球重點(diǎn)監(jiān)控的食源性病原菌，快速、低成本檢測是發(fā)展方向，傳統(tǒng)的單增李斯特菌的檢測方法主要有國標(biāo)法、酶聯(lián)免疫和PCR方法，國標(biāo)法雖然成本低，但培養(yǎng)時(shí)間較長，且容易漏檢；酶聯(lián)免疫法是蛋白質(zhì)水平的檢測方法，靈敏度高于國標(biāo)法，但有較多的影響因素，如加樣方式、溫育溫度、洗滌方法等，實(shí)驗(yàn)的過程性分析較為復(fù)雜；普通PCR法擴(kuò)增后，通過電泳條帶判斷目標(biāo)產(chǎn)物大小，但是不能排除非特異性擴(kuò)增，且很多電泳染料不利于人體健康；實(shí)時(shí)熒光PCR具有較高的靈敏度和特異性，但是需要昂貴的儀器設(shè)備，不易在基層應(yīng)用，且儀器設(shè)備通常體積較大，不易進(jìn)行戶外或現(xiàn)場檢測；近年來廣泛被研究的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測法雖然反應(yīng)過程簡單，無需使用PCR儀，但設(shè)計(jì)復(fù)雜，對靶序列要求較高，且耗時(shí)較長?；诎谢驒z測的各種基因體外放大技術(shù)，都沒法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測， HDA方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以真正意義上達(dá)到恒溫?cái)U(kuò)增，作為一種新的恒溫?cái)U(kuò)增方法，HDA模擬生物體內(nèi)DNA的合成方法，由解旋酶解開DNA雙鏈替代PCR中的高溫，擴(kuò)增原理簡單，耗時(shí)較短。普通的HDA擴(kuò)增只需要一個(gè)恒溫的環(huán)境即可進(jìn)行，對設(shè)備要求較低。由以上實(shí)驗(yàn)可知實(shí)時(shí)熒光HDA具有較高的靈敏度和特異性，因?yàn)槭切滦偷姆椒?，所以目前的?shí)時(shí)熒光HDA實(shí)驗(yàn)是基于熒光定量PCR儀進(jìn)行的。本課題組基于HDA擴(kuò)增原理，在研究對應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光HDA儀器，相信在不久的將來，低成本、易操作的實(shí)時(shí)熒光HDA儀有望應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光HDA檢測方法可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增無需大型設(shè)備，且檢測靈敏度和特異性等同于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，未來在配備相關(guān)設(shè)備后，將具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

[1] KATHARIOU S. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety perspective[J]. Food Protection, 2002, 65(11): 1811-1829.

[2] VAZQUEZ-BOLAND J A, KUHN M, BERCHE P, et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J]. Clinical Microbiol Reviews, 2001, 14(3): 584-640.

[3] JAY J M, LOESSNER M J, GOLDEN D A. 現(xiàn)代食品微生物學(xué)[M].何國慶, 丁立孝, 宮春波, 等, 譯. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2008.

[4] LIU Dongyou, AINSEORTH A J, AUSTIN F W, et al. Use of PCR Primers derived from a putative transcriptional regulator gene for species-specific determination of Listeria monocytogenes[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 91(3): 297-304.

[5] 徐義剛, 崔麗春, 李丹丹, 等. 食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(16): 137-141.

[6] 江漢湖. 食品微生物學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

[7] 何冬梅, 鄧峰, 賴蔚苳, 等. 單核細(xì)胞增生李斯特菌生物學(xué)研究進(jìn)展[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué), 2006, 32(6): 26-29.

[8] 梅玲玲, 王晶, 孟真, 等. Taq Man-MGB探針Real-time PCR快速檢測單增李斯特菌的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007, 17(2): 211-213.

[9] 國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 4789.30—2008 單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[10] VINCENT M, XU Yan, KONG Huimin. Helicase-dependent isothermal DNA amplification[J]. EMBO Reports, 2004, 5(8): 795-800.

[11] 陳璐, 沈建箴. 賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010, 16(13): 1932-1934.

[12] JEONG Y J, PARK K, KIM D E. Isothermal DNA amplification in vitro: helicase-dependent amplification system[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2009, 66(20): 3325-3336.

[13] CHAVOLLA E T, ALOCILJA E C. Nanoparticle based DNA biosensor for tuberculosis detection using thermophilic helicasedependent isothermal amplification[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2011, 26(11): 4614-4618.

[14] TIAN Leilei, WEIZMANN Y. Real-time detection of telomerase activity using the exponential isothermal amplification of telomere repeat assay[J]. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(5): 1661-1664.

[15] CAO Anping, ZHANG Chunyang. Real-time detection of transcription factors using target-converted helicase-dependent amplification assay with zero-background signal[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(4): 2543-2547.

[16] RAMALINGAM N, SAN T C, KAI T J, et al. Microfluidic Devices harboring unsealed reactors for real-time isothermal helicase-dependent amplification[J]. Microfluid Nanofluid, 2009, 7(3): 325-336.

[17] MAHALANABIS M, DO J, ALMUAYAD H, et al. An integrated disposable device for dna extraction and helicase dependent amplification[J]. Biomed Microdevices, 2010, 12(2): 353-359.

[18] 王建廣, 雷質(zhì)文, 劉云國, 等. 志賀菌依賴解旋酶DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2012, 28(4): 550-552.

[19] 梁煒, 張京宣, 張?jiān)葡? 等. 基于HDA的超級細(xì)菌耐藥基因NDM-1檢測方法的建立[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2011, 2(3): 152-158.

[20] GILL P, AMINI M, GHAEMI A, et al. Detection of Helicobacter pylori by enzyme-linked immunosorbent assay of thermophilic helicase-dependent isothermal dna amplification[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59(3): 243-249.

[21] O’NEIL D, DOSEEVA V, ROTHMANN T, et al. Evaluation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae detection in urine, endocervical, and vaginal specimens by a multiplexed isothermal thermophilic helicase-dependent amplification (tHDA) assay[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2011, 49(12): 4121-4125.

[22] 孔德壯. 單增李斯特菌溶血素O單克隆抗體的制備及其間接夾心ELISA檢測方法的初步建立[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010.

[23] 劉海瑞. 單核細(xì)胞增多性李斯特菌hly基因的克隆表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立[D]. 大慶: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 2009.

[24] MOUSHUMI P, GIAN M B, SABRIAN A, et al. Direct, quantitative detection of Listeria monocytogenes in fresh raw whole milk by qPCR[J]. Internation Dairy Journal, 2015, 41: 46-49.

[25] WANG Guangyu, QIAN Wenjuan, ZHANG Xinxiao, et al. Prevalence, genetic diversity and antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolated from ready-to-eat meat products in Nanjing, China[J]. Food Control, 2015, 50: 202-208.

Real-Time Fluorescence Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification Method for Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Foods

ZHANG Mingru1, RAO Li1, WANG Jianguang1, JIE Li2, DING Hongliu2, SHEN Xiaofang1,*
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Suzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute, Suzhou 215104, China)

The purpose of this study was to develop a real-time helicase-dependent isothermal DNA amplification (HDA) method for the rapid detection of Listeria monocytogenes. Based on the platform of real-time PCR, pairs of primers targeting the hemolysin gene (hly) of Listeria monocytogenes were designed, and genomic DNA was extracted from a standard strain of L. monocytogenes for use as the template. The reaction temperature, primers and template DNA concentration were optimized. Compared with real-time PCR method, the specificity and sensitivity of the real-time HDA method were evaluated with L. monocytogenes and 10 bacteria control strains, and then this developed method was used to detect L. monocytogenes in real samples. The results showed that the optimal primer concentration, reaction temperature and time for real-time HDA system were 0.075 mol/L, 65 ℃ and 80 min (40 cycles), respectively. This system showed a high specificity and sensitivity. Thus a real-time HDA method for rapid and specific detection of L. monocytogenes has been successfully established.

Listeria monocytogenes; hemolysin gene; helicase-dependent isothermal amplification; real-time fluorescence HDA; rapid detection

R155.5

A

10.7506/spkx1002-6630-201510041

2014-08-18

蘇州科技局科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(SS201338)

張明如(1988—),女,碩士,研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：yyzmrhxn@163.com

*通信作者：沈曉芳(1976—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：xfshen@jiangnan.edu.cn