黃 婷,范遠景,*,孟 靜,張 帆,耿保玉,劉培志,王明和

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009；2.安徽劉郎食品有限公司,安徽 宣城 242000)

正交試驗優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體制備工藝及其分子表征

黃 婷1,范遠景1,*,孟 靜1,張 帆1,耿保玉1,劉培志2,王明和2

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009；2.安徽劉郎食品有限公司,安徽 宣城 242000)

研究用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為載體包裹靈芝三萜制備納米體的工藝與其分子表征；采用去溶劑化-化學交聯(lián)法制備靈芝三萜白蛋白納米體，以白蛋白納米體包封率為主要評價指標，采用正交試驗設計法優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體的配方。結果表明:將BSA 50 mg溶于5 mL去離子水中，取靈芝三萜8 mg溶于25 mL無水乙醇中，水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，加入0.25%的戊二醛溶液125 ?L，室溫條件下固化12 h，減壓濃縮除去乙醇，得到的靈芝三萜白蛋白納米體粒徑為（189±11.13）nm，多分散指數(shù)為0.227±0.016，Zeta電位為（-31.4±6.74）mV，包封率為（80.10±1.05）%，載藥量為（11.36±0.13）%，納米體溶液于4 ℃放置30 d，穩(wěn)定性良好。

靈芝三萜；牛血清白蛋白；納米體；穩(wěn)定性

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種食藥兼用的真菌，被譽為“不朽的蘑菇”，其主要的兩大活性成分是三萜和多糖[1-3]。靈芝三萜類化合物具有廣泛的生理活性和藥理作用，如:降血脂、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝護肝、提高免疫力、抗衰老、抑制癌細胞生長、毒殺腫瘤細胞等[4-11]。但靈芝三萜難溶于水，能溶于氯仿、乙醇、甲醇等有機溶劑，文獻[12]報道靈芝三萜生物利用度低，特別是酸性三萜入血較快，口服靈芝酸A（50 mg/kg），18 min血藥濃度就達到最高峰[13]。為了增強靈芝三萜的溶解度及改善吸收，提高生物利用度，可將靈芝三萜制成白蛋白載藥微粒。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是生命體血漿中含量最豐富的蛋白質，較容易得到純度高的BSA蛋白樣品，白蛋白分子中的氨基酸相互扭曲成團狀或蜂窩狀，具有大量的空隙，空間結構有利于攜帶藥物[14]。BSA可以通過物理或化學手段與藥物結合，起到重要的貯存和運輸?shù)淖饔?，并能使藥物在體內緩慢釋放[15-18]。用白蛋白納米體包封研究的藥物主要有阿霉素、紫杉醇等。紫杉醇白蛋白納米粒的問世避免了以往紫杉醇注射劑因溶解問題帶來的一系列副作用，并大大提高了紫杉醇的溶解性。多項研究已證實，其在多種腫瘤的治療中取得突破性進展[19-20]。本研究采用去溶劑化-化學交聯(lián)法制備靈芝三萜白蛋白納米體，優(yōu)化其制備工藝，并初步研究了其理化性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白 上海源聚生物科技有限公司；靈芝三萜（純度80%） 鄭州荔諾生物科技有限公司；香草醛、無水乙醇、戊二醛、高氯酸、冰醋酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

78-1型加熱磁力攪拌器 杭州儀表及電廠；JEM-2100場發(fā)射透射電子顯微鏡 日本電子制造公司；Nano-ZS90 Zeta電位儀 英國Malvern公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo公司；紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；R-201旋轉蒸發(fā)儀 上海勝申生物技術有限公司；TGC-16C臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 靈芝三萜標準曲線的繪制

精確稱取靈芝三萜標準樣品5 mg，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度。分別吸取標準溶液0.00、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于試管中，在100 ℃水浴上蒸干。然后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL和高氯酸1.6 mL，迅速混合均勻。再將試管置于70 ℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，冷卻至室溫后，加入8 mL冰醋酸搖勻置于室溫。15 min后用分光光度計在545 nm波長條件下測定其吸光度。以靈芝三萜質量（mg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 靈芝三萜白蛋白納米體的制備

取一定量的BSA溶于去離子水中，使其充分溶解。再取處方量靈芝三萜溶于一定量的無水乙醇中。水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，至乳白色膠狀液形成。滴加結束以后迅速滴入一定量的0.25%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌固化12 h。在40 ℃條件下旋轉蒸發(fā)除去乙醇，剩余膠狀液12 000 r/min冷凍離心20 min。除去上清液，沉淀部分用去離子水復溶，并定容至10 mL，即得到負載靈芝三萜的白蛋白納米體混懸液。

1.3.3 單因素試驗

白蛋白納米體的評價指標有很多，如載藥量、包封率、粒徑分布、理化穩(wěn)定性等[21]，其中包封率是衡量白蛋白納米體的重要指標，故以包封率為評價指標進行處方篩選。以靈芝三萜白蛋白納米體的制備方法為基礎，采用單因素試驗系統(tǒng)考察BSA質量（30、40、50、60 mg）、無水乙醇體積（10、15、20、25 mL）、靈芝三萜質量（4、8、10、12 mg）、0.25%戊二醛溶液體積（100、125、150、175 ?L）這4 個因素對白蛋白納米體包封率的影響。試驗中考察主要因素時其余因素全部選擇水平3。

1.3.4 正交設計法優(yōu)化靈芝三萜白蛋白納米體配方

在單因素試驗的基礎上，擬定了L9（34）正交表進行試驗，因素水平見表1。

1.3.5 靈芝三萜白蛋白納米體包封率和載藥量的測定

取攪拌均勻的納米體混懸液分裝到離心管中，12 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL置于試管中，在100 ℃水浴上蒸干。然后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL和高氯酸1.6 mL，迅速混合均勻。再將試管置于70 ℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，冷卻至室溫后，加入8 mL冰醋酸搖勻置于室溫。以空白白蛋白納米體作為對照組，15 min后用分光光度計在545 nm波長條件下測吸光度，并代入標準曲線方程，計算其所對應的靈芝三萜質量作為M游。按式（1）、（2）計算包封率和載藥量。

式中:M總為總的靈芝三萜加入量/mg；M游為未被包裹的靈芝三萜質量/mg；MBSA為BSA的加入量/mg。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

分別取干燥的靈芝三萜、空白白蛋白納米體、靈芝三萜白蛋白納米體和空白白蛋白納米體與靈芝三萜混合物各2.0 mg，加入100～200 mg溴化鉀晶體，用石英研缽研細，將粉末裝入模具內，用壓片機壓制成片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內掃描得到FT-IR分析。

1.3.7 靈芝三萜白蛋白納米粒的形態(tài)、Zeta電位、粒徑及粒徑分布測定

1.3.7.1 透射電子顯微鏡觀察納米體的形態(tài)

取靈芝三萜白蛋白納米體混懸液稀釋到適當倍數(shù)，取一滴滴在銅網(wǎng)上，自然揮干，干燥后用JEM-2100透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

1.3.7.2 納米體電勢和粒徑測定

取靈芝三萜白蛋白納米體混懸液稀釋到適當倍數(shù)，用Zeta電位儀測定納米體電位、粒徑及粒徑分布。

1.3.8 靈芝三萜白蛋白納米體穩(wěn)定性初步考察

將制備好的納米體分裝到小瓶內，密封，置于冰箱中（4 ℃）。分別于0、10、20、30 d取樣，用Zeta電位儀測樣品粒徑和多分散指數(shù)，用測包封率的方法測游離靈芝三萜的量 ，并計算貯存過程中的滲透率。如式（3）所示。

式中:M0為制備剛完成時游離靈芝三萜的量/mg；M包封為制備剛完成時被包封靈芝三萜的量/mg；Mn為儲存n d后游離靈芝三萜的量/mg。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

按1.3.1節(jié)的步驟進行實驗，根據(jù)靈芝三萜的含量（mg）和吸光度的關系，建立線性回歸方程: Y= 3.308 6X-0.002 6，R2為0.999 5，表明靈芝三萜在0～0.12 mg范圍內呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

固定其他條件，改變BSA質量、無水乙醇體積、靈芝三萜質量、0.25%戊二醛溶液體積，考察其對白蛋白納米體包封率的影響。

由圖1可見，隨著BSA質量的增大，包封率先增大后減小。由此可見在一定范圍內增大BSA的用量可使包封的靈芝三萜量隨之增大，但是由于交聯(lián)劑戊二醛的體積一定，所以當BSA的用量增加到50 mg以上時，它不能很好的交聯(lián)成球，故使包封率下降。

由圖2可見，當靈芝三萜質量和水的體積一定時，隨著無水乙醇體積增大，包封率先增大而后又減小。說明在一定范圍內，靈芝三萜質量濃度越小包封效果越好，之后出現(xiàn)下降的趨勢可能是受乙醇和水比例的影響。

由圖3可見，隨著靈芝三萜加入量的增加，包封率也隨之增加，但當靈芝三萜的加入量增至10 mg，再增加加入量時包封率出現(xiàn)下降，這是由于納米體對芯材物質的包埋有飽和性，并非芯材物質的加入量越多包封率越大。

由圖4可見，在一定范圍內戊二醛的使用量增加可使包封率有所增加。戊二醛用量增加使納米體的內部交聯(lián)度增高，交聯(lián)速率加快，從而抑制了藥物向油相的擴散，使藥物包封率增加。與其他因素相比較，戊二醛的使用量對白蛋白納米體包封率的影響較小。

2.3 正交試驗設計與結果

由表2可見，在本實驗所選用的因素和水平條件下，最優(yōu)組合條件為A3B3C1D2，各因素對包封率影響的程度為A＞C＞B＞D。即BSA的質量為50 mg溶于5 mL水中，靈芝三萜的加入量8 mg、無水乙醇的體積25 mL、0.25%戊二醛溶液加入體積125 ?L?？梢钥闯?，最優(yōu)組合在9 次試驗中沒有出現(xiàn)，其中9 次試驗中8號A3B2C1D3所制備的納米體的包封率最高。將組合A3B3C1D2和A3B2C1D3同時進行驗證，結果按組合方案A3B3C1D2制備的納米體包封率為（80.10±1.05）%，載藥量為（11.36±0.13）%。所以A3B3C1D2為最優(yōu)組合方案。

2.4 FT-IR分析

FT-IR可以高效快速地測定被分析物中分子的吸收光譜，不同的物質有不同的特征吸收峰，可表征其基本化學結構和組成[22]。從圖5可看出，3 360 cm-1是靈芝三萜中O—H伸縮振動吸收峰，2 930 cm-1為飽和C—H伸縮振動，1 630 cm-1是靈芝三萜的α、β不飽和酮的特征吸收峰，1 410 cm-1為—CH2—的變角振動，1 030 cm-1為C—O伸縮振動。從譜圖中可以看出，靈芝三萜在1 030 cm-1有明顯的C—O峰，而空白白蛋白納米體在1 030 cm-1處無此峰，空白白蛋白納米體在1 240 cm-1處有C—N峰，靈芝三萜白蛋白納米體的紅外圖譜中均出現(xiàn)靈芝三萜和空白白蛋白納米體的特征峰，說明白蛋白納米體中有靈芝三萜；靈芝三萜白蛋白納米體在1 240 cm-1處有明顯的C—N峰，而靈芝三萜與空白白蛋白納米體的混合物在此處峰不明顯，由此推斷靈芝三萜白蛋白納米體的表面主要為蛋白分子，說明靈芝三萜被白蛋白包埋；此外，靈芝三萜在1 030 cm-1處有C—O伸縮振動，此峰在靈芝三萜白蛋白納米體中吸收強度明顯弱于在混合物中的吸收強度，進一步說明靈芝三萜被白蛋白包裹成功。

2.5 白蛋白納米粒的形態(tài)、電位、粒徑及粒徑分布測定結果

由透射電鏡拍攝的照片可顯示靈芝三萜白蛋白納米粒呈現(xiàn)規(guī)整的圓球形，邊緣光滑，在水中的分散性較好，粒徑分布基本勻稱。通過單個納米粒放大圖片可以觀察到明顯的包裹結構，結合紅外圖譜的分析可推斷納米體內層為靈芝三萜，外殼為白蛋白球，結果見圖6。

多指數(shù)分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）是反映納米體系中粒徑分布范圍的指標，PDI值越小，說明粒徑分布范圍越窄，即體系中粒子的粒徑具有較好的規(guī)整度[23]。用Zeta電位儀測定納米體的平均粒徑是（189±11.13）nm，PDI為0.227±0.016，結果見圖7。實驗制備的靈芝三萜白蛋白納米體的Zeta電勢為（-31.4±6.74）mV，與Peters[24]報道在自然狀態(tài)下BSA分子表面電勢為-18 mV相比較，BSA乳化交聯(lián)后形成的牛血清白蛋白納米體表面的電勢升高，納米體之間的靜電斥力增加，有利于阻止納米體之間的聚集。結合PDI、Zeta電勢值和電鏡拍攝的結果可初步說明所制備的納米體混懸液穩(wěn)定性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗結果

靈芝三萜白蛋白納米體存放期間的物化穩(wěn)定性是其應用的一個非常重要的方面，因為納米體在體內的循環(huán)過程中為了保持芯材的活性以及達到緩釋和靶向釋放的功能必須能保證納米體球形結構的完整性[25]。靈芝三萜白蛋白納米體混懸液在4 ℃條件下放置30 d后外觀上未見分層、絮凝、沉淀、變色等明顯變化。從表3可見，隨著存放時間的延長藥物的滲透率呈增大的趨勢，但總體滲透率較低，不超過4%，平均粒徑基本保持在200 nm左右，變化較小；PDI始終顯示較低，納米粒具有均一的分散性。由此說明靈芝三萜白蛋白納米體在4 ℃貯存條件下能保持良好的穩(wěn)定性。

3 結 論

本實驗研究以去溶劑化-化學交聯(lián)法成功制備了靈芝三萜白蛋白納米體，通過正交優(yōu)化試驗制得包封率較高產品的同時，可以使靈芝三萜白蛋白納米體的平均粒徑不超過200 nm。放置30 d后納米體外觀、PDI、粒徑以及滲透率變化很小，具有良好的穩(wěn)定性。結果表明靈芝三萜白蛋白納米體的最佳配方為將BSA 50 mg溶于5 mL去離子水中，取靈芝三萜8 mg溶于25 mL無水乙醇中，水相以400 r/min持續(xù)攪拌的同時以1 mL/min的速率滴加靈芝三萜乙醇溶液，加入0.25%的戊二醛溶液125 ?L，室溫條件下固化12 h，減壓濃縮除去乙醇。

[1] KO H H, HUNG C F, WANG J P, et al. Anti-inflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma lucidum and G. tsugae[J]. Phytochemistry, 2008, 69: 234-239.

[2] 趙繼鼎, 張小青. 中國真菌志: 第十八卷[M]. 北京: 科學出版社, 2000: 116-119.

[3] 藺麗, 方能虎, 吳旦. 靈芝的主要生物活性研究概況[J]. 中國食用菌, 1998, 21(3): 38-40.

[4] 黃艷娟, 肖桂林. 靈芝三萜藥理學作用研究進展[J]. 中醫(yī)藥導報, 2008, 14(9): 87-88.

[5] CARMEN W H, XIN D. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components[J]. Journal of Chromatography B, 2004, 812: 241-257.

[6] LIU Jie, SHIMIZU K, KONISHI F, et al. Anti-androgenic activities of the triterpenoids fraction of Ganoderma lucidum[J]. Food Chemistry, 2007, 100(4): 1691-1696.

[7] 林志彬. 靈芝抗腫瘤和免疫調節(jié)作用的研究進展[J]. 北京大學學報:醫(yī)學版, 2002, 34(5): 493-498.

[8] STANLEY G, HARVEY K, SLIVOVA V, et al. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-1 from prostate cancer cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 330(1): 46-52.

[9] ZHANG Guoliang, WANG Yehong, NI Wei, et al. Hepatoprotective role of Ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World Journal Gastroenterology, 2002, 8(4): 728-733.

[10] YUE Qingxi, CAO Zhiwei, GUAN Shuhong, et al. Proteomics characterization of the cytotoxicity mechanism of ganoderic acid D and computer-automated estimation of the possible drug target network[J]. Molecular and Cellular Proteomics, 2008, 7(5): 949-961.

[11] YUE Qingxi, SONG Xiaoyi, MA Chao, et al. Effects of triterpenes from Ganoderma lucidum on protein expression profile of HeLa cells[J]. Phytomedicine, 2010, 17(8): 606-613.

[12] ZHANG Qun, ZUO Feng, NAKAMURA N, et al. Metabolism and pharmacokinetics in rats of ganoderiol F, a highly cytotoxic and antitumor triterpene from Ganoderma lucidum[J]. Journal of Natural Medicines, 2009, 63(3): 304-310.

[13] WANG Xiaoming, LIU Rongxia, SUN Jianghao, et al. HPLC method for the determination and pharmacokinetic studies of four triterpenoids in rat plasma after oral administration of Ganoderma lucidum extract[J]. Biomedical Chromatography, 2007, 21(4): 389-396.

[14] TARR B D, SAMBANDAN T G, YALKOWSKY S H. A new parenteral emulsion for the administration of taxol[J]. Pharmaceutical Research, 1987, 4(2): 162-165.

[15] 羅俊, 林志彬. 靈芝三萜類化合物藥理作用研究進展[J]. 藥學學報, 2002, 37(7): 574-578.

[16] JAYABHARATHI J, THANIKACHALAM V, PERUMAL M V. A study on the binding interaction between the imidazole derivative and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy[J]. Journal of Luminescence, 2012, 132(3): 707-712.

[17] MUSTHABA S, BABOOTA S, AHMED S, et al. Status of novel drug delivery technology for phytotherapeutics[J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2009, 6(6): 625-637.

[18] COOMBES A G A, BREEZE V, LIN Wu, et al. Lactic acid-stabilised albuminfor microsphere formulation and biomedical coatings[J]. Biomaterials, 2001, 22(1): l-8.

[19] GRADISHAR W J, TJULANDIN S, DAVIDSON N, et al. PhaseⅢ trial of nanoparticle albuminbound paclitaxel compared with polyethylated castor oil-based paclitaxel in women with breast cancer[J]. Journal of Clinical Oncology, 2005, 23(31): 7794-7803.

[20] HALEY B, FRENKEL E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment[J]. Urologic Oncologic, 2008, 26(1): 57-64.

[21] 樊繼波, 陳永斌, 周杰. 白蛋白微球的制備方法及評價的研究進展[J].天津藥學, 2009, 21(3): 58-61.

[22] 范雪芳, 徐淼, 侯曉濤, 等. 紅外光譜分析技術及其應用[J]. 成都醫(yī)學院學報, 2009, 4(3): 217-219.

[23] RUOZI B, TOSI G, FORNI F, et al. Atomic force microscopy and Photon correlation spectroscopy: two techniques for rapid characterization of liposomes[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2005, 25(1): 81-89.

[24] PETERS T. Serum albumin[J]. Advances in Protein Chemistry, 1985, 37: 161-245.

[25] BENITA S. Microencapsulation: methods and industrial applications[M]. New York: Marcel Dekker, 1996: 299-305.

Optimization of the Preparation Procedure and Molecular Characterization of Ganoderma lucidum Triterpenoids-Bovine Serum Albumin Nanoparticles by Orthogonal Array Design

HUANG Ting1, FAN Yuanjing1,*, MENG Jing1, ZHANG Fan1, GENG Baoyu1, LIU Peizhi2, WANG Minghe2
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Liu Lang Food Co. Ltd., Xuancheng 242000, China)

Purpose: To prepare and characterize Ganoderma lucidum triterpenoids-bovine serum albumin (BSA) nanoparticles. Methods: Ganoderma lucidum triterpenoids-BSA nanoparticles were prepared by desolvation-chemical crosslinking method and the preparation conditions were optimized with respect to entrapment efficiency by orthogonal array design. Results: Nanoparticles with an average particle size of (189 ± 11.13) nm, a polydispersity index (PDI) of 0.227 ± 0.016, a zeta potential of (-31.4 ± 6.74) mV, an entrapment efficiency of (80.10 ± 1.05)%, and a drug-loading efficiency of (11.36 ± 0.13)% were obtained by dropwise addition of 8 mg of Ganoderma lucidum triterpenoids dissolved in 25 mL of absolute ethanol to 50 mg/mL aqueous solution of BSA while constantly stirring the mixture at a speed of 400 r/min and subsequent prompt addition of 125 ?L of 0.25% glutaraldehyde. The nanoparticles were stable at 4 ℃ for 30 d.

Ganoderma lucidum triterpenoids; bovine serum albumin; nanoparticles; stability

TS201.4

A

10.7506/spkx1002-6630-201510010

2014-11-18

安徽省鴨肉制品工程技術研究中心項目(201306G01054)；皖江禽產業(yè)研究院公共服務平臺項目(1401032006)

黃婷(1989—),女,碩士研究生,研究方向為食品生物技術。E-mail：huangtinganhui@sina.com

*通信作者：范遠景(1958—),男,教授,博士,研究方向為食品科學。E-mail：swf89105@hfut.edu.cn