王 月，張東杰,*，王 穎,2,*，梁小月，徐炳政

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧技術(shù)工程研究中心,黑龍江 大慶 163319)

響應(yīng)面優(yōu)化雙水相萃取分離酵母源MT工藝

王 月1，張東杰1,*，王 穎1,2,*，梁小月1，徐炳政1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧技術(shù)工程研究中心,黑龍江 大慶 163319)

采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-(NH4)2SO4雙水相體系，分離銅誘導(dǎo)的誘變釀酒酵母菌所表達(dá)的金屬硫蛋白。以PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值為考察因素，萃取率為響應(yīng)值，結(jié)合Design-Expert 8.0.6軟件做響應(yīng)面優(yōu)化分析，優(yōu)化到最佳萃取條件:PEG相對分子質(zhì)量2 000、PEG和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.5%和17.46%、pH 5.98。獲取的金屬硫蛋白主要分布在上相，萃取率可達(dá)81.69%。此方法操作簡單、高效、成本低，是酵母源金屬硫蛋白分離提純的新方法。

金屬硫蛋白；雙水相萃??；響應(yīng)面分析；分配系數(shù)；萃取率

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類分子質(zhì)量低、含豐富半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白[1]，廣泛存在于植物、動物以及微生物體內(nèi)，能被多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。不同來源MT的等電點也不同，如哺乳類動物MT的pI在3.9～4.6之間，已發(fā)現(xiàn)的水生生物MT的pI在3.5～6.0之間。MT的分子質(zhì)量較小，其范圍大致為2 000～16 000 kD，MT構(gòu)象較堅固，熱穩(wěn)定性強[2]。其具有清除自由基，調(diào)節(jié)鋅、銅等微量元素代謝，解除鉛、砷、汞等重金屬毒素，抗電離輻射等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[3-5]。

目前常用的分離純化MT方法包括層析法、DEAESepharose Fast Flow法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等[6-9]，但這些方法大多停留在實驗室階段。雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)，具有體系含水量高、分相時間短、萃取環(huán)境溫和使蛋白質(zhì)在其中不易變性、生物相容性高、易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作等諸多優(yōu)勢[10-11]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及氨基酸的分離和純化[12-13]。本實驗采用聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系，通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化得到雙水相萃取酵母源MT的最佳條件，為酵母源金屬硫蛋白的分離提純及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母N-8 實驗室誘導(dǎo)分離保存菌株；酵母菌MT酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海勁馬生物科技有限公司；YPD液體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；FS-450N型超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；TD5A-WS臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MT的誘導(dǎo)合成及粗提液的制備

將實驗室保存的釀酒酵母菌按2%的接菌量接至活化YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、24 h搖床活化，再按2%接菌量將活化種子液接入含0.7 mmol/L CuCl2溶液的誘導(dǎo)YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、62 h搖床培養(yǎng)[14-15]。之后3 000 r/min離心25 min，去上清液收集菌體，菌體與0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.6）緩沖液按1∶5的體積比充分混勻，冰浴條件下超聲波破壁處理混合液，功率287 W、時間32 min。離心收集上清液，80 ℃水浴中熱變性8 min，迅速冷卻后離心收集上清液，得到MT含量約為170 ng/L的粗蛋白提取液[16]。

1.3.2 雙水相萃取酵母源MT

固定體系總質(zhì)量為10.00 g，分別加入2 g聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、2 g (NH4)2SO4和1 g樣品溶液，其余質(zhì)量用超純水補足，形成雙水相體系。振蕩使成相物質(zhì)充分混勻，調(diào)節(jié)pH 5，靜置到兩相達(dá)到相分離，MT富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，用移液管吸取上下相溶液并讀取上下相體積，求相比R；分別測定上下相MT質(zhì)量濃度，計算MT的分配系數(shù)K及萃取率Y，如式（1）～（3）所示:

式中:V1為上相體積/mL；V2為下相體積/mL；ρ1為上相中MT的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ2為下相中MT的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3 MT含量及抗氧化性測定

MT含量的測定采用酵母菌MT酶聯(lián)免疫分析法[17]，體外清除羥自由基能力的測定采用分光光度計法[18]。

1.3.4 雙水相萃取的單因素試驗

影響雙水相萃取的因素很多，本實驗重點研究了PEG的相對分子質(zhì)量（600、1 000、2 000、4 000、6 000）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5%、10%、15%、20%、25%）、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（15%、20%、25%、30%、35%）、pH值（3、4、5、6、7）、溫度（20、25、30、35、40 ℃）5個因素對酵母源MT萃取率的影響。根據(jù)20%聚乙二醇（相對分子質(zhì)量2 000）、20% (NH4)2SO4、pH 6、溫度25 ℃成相條件，改變其中1 個因素，其他條件不變，分別對上述5 個因素進(jìn)行單因素考察。每個單因素試驗均做3 個平行樣品，計算其平均萃取率和平均分配系數(shù)。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件

Box-Behnken試驗設(shè)計是響應(yīng)面分析設(shè)計試驗中利用合理的試驗設(shè)計且通過前期試驗得到一定的數(shù)據(jù)，采用多元二次方程方法來擬合響應(yīng)面值及因素之間的函數(shù)關(guān)系，采用回歸方程來分析以尋求多因素系統(tǒng)中最優(yōu)的提取條件的一種統(tǒng)計學(xué)方法[19-20]。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，在PEG的相對分子質(zhì)量2 000、溫度25 ℃的條件下，選擇PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、pH值（X3）3 個對酵母源MT萃取率影響較大的因素設(shè)計三因素三水平優(yōu)化試驗，因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同相對分子質(zhì)量PEG對MT萃取的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設(shè)定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 6、溫度25 ℃，改變PEG相對分子質(zhì)量，比較雙水相體系的MT分配系數(shù)及萃取率。

由圖1可以看出，當(dāng)PEG的相對分子質(zhì)量小于2 000時，隨著PEG相對分子質(zhì)量的升高，MT的分配系數(shù)和萃取率均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。主要是隨PEG的相對分子質(zhì)量增大，分子鏈長度增加，分子內(nèi)部極性基團(tuán)的羥基相對減少，疏水性增加，界面張力增大，促使MT富集于上相，MT的分配系數(shù)和萃取率隨之增加。但當(dāng)PEG的相對分子質(zhì)量大于2 000時，隨著PEG相對分子質(zhì)量的繼續(xù)增大，黏度也隨之增大，MT在兩相間的傳遞和在相中的擴散阻力增加阻礙MT向上相富集，從而使MT的分配系數(shù)和萃取率下降[21]，綜合考慮選擇PEG 2 000為成相物質(zhì)。

2.1.2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MT萃取的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設(shè)定(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 6、溫度25 ℃，改變PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)，比較雙水相體系的MT分配系數(shù)及萃取率。由圖2可知，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，MT萃取率及分配系數(shù)隨之增加。此現(xiàn)象主要是由于PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)增加，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點，兩相性質(zhì)的差別增大，利于MT富集于PEG相中。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%后，繼續(xù)增大PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)，成相物質(zhì)分子間的作用、相界面張力、系統(tǒng)的黏度也會增大，導(dǎo)致溶質(zhì)在相間的傳遞和在相內(nèi)的擴散阻力增加，反而不利于MT進(jìn)入PEG相，所以MT的分配系數(shù)及萃取率降低，故PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%為最佳值。

2.1.3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設(shè)定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 6、溫度25 ℃，改變(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，比較雙水相體系的MT分配系數(shù)及萃取率。

從圖3可知，雙水相體系中(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時，MT的萃取率最高，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，不僅破壞了MT表面的水化層，使之發(fā)生鹽析，而且還會擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比，下相水分含量升高，下相的體積增大，MT有不斷向下相分配的趨勢，所以MT萃取率逐漸下降。雖然(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時MT分配系數(shù)最大，但相比減小，萃取率減少，綜合考慮選擇(NH4)2SO4為20%為最佳值。

2.1.4 pH值對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設(shè)定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、溫度25 ℃，改變pH值，比較雙水相體系MT分配系數(shù)及萃取率。

由圖4可知，雙水相體系的pH值為3～7時，MT萃取率及分配系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)選擇雙水相體系為一種無機鹽和一種PEG時，鹽的正、負(fù)離子對兩相具有不同的親和力，它們在雙水相體系中的分配能力不同，上相顯示為正電性，下相顯示為負(fù)電性[22]。據(jù)報道酵母源MT的等電點在5.0左右[23]，當(dāng)雙水相體系pH值大于MT等電點時，MT易富集于上相；當(dāng)雙水相體系pH值小于MT等電點時，MT易于向下相富集。pH值的改變也會影響雙水相系統(tǒng)中無機離子的分配情況及兩相之間的電位差，從而影響MT的分配系數(shù)和萃取率。在pH 6時MT萃取率及分配系數(shù)均達(dá)到最大值，故體系的pH值在6左右為最佳。

2.1.5 溫度對MT萃取率的影響

PEG-(NH4)2SO4雙水相體系中，設(shè)定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH 6，改變溫度，比較雙水相體系的MT分配系數(shù)及萃取率。

由圖5可知，體系的溫度20～40 ℃范圍內(nèi)MT的萃取率及分配系數(shù)均有所上升，推測當(dāng)溫度上升，雙水相體系內(nèi)分子運動的加強降低了靜電排斥作用，使MT的分配系數(shù)和萃取率增加。但隨著溫度的升高，MT的分配系數(shù)和萃取率增加幅度較小，考慮到常溫條件下雙水相體系溶液的黏度低、易分相，實際生產(chǎn)中操作節(jié)省成本等問題，故體系的溫度設(shè)定為25 ℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 MT萃取響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

依照表1的試驗因素與水平設(shè)計，采用Design-Expert 8.0.6軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計，以MT萃取率作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程的方差分析結(jié)果

通過 Design-Expert 8.0.6軟件模擬得到PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、pH值（X3）對MT萃取率（Y）的二次多項回歸模型方程為:

方程中各因素系數(shù)絕對值大小反映了該因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映影響的方向[24]?；貧w方程方差分析如表3所示，該模型的P值小于0.000 1，失擬項（P＞0.05）不顯著，方程決定系數(shù)R2＞0.9，說明所選模型極為顯著，模型與真實值的擬合度較高。

2.2.3 響應(yīng)面分析

雙水相萃取酵母源MT的響應(yīng)面見圖6，結(jié)合表3回歸方程方差分析可知，各因素對MT萃取率影響大小為X1＞X3＞X2，即PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對MT萃取率影響最大，其次為pH值及(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。交互相中X1X3極顯著（P＜0.001），說明PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)與體系pH值間的交互作用較強，X2X3顯著（P＜0.05），說明(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)與pH值間的具有交互作用，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的交互作用不顯著。

2.2.4 確定最佳工藝條件

雙水相萃取酵母源MT的最佳工藝條件為常溫（25 ℃左右） PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.5%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.46%、pH 5.98，在此工藝條件下MT的萃取率可達(dá)81.87%。在此條件下進(jìn)行3次平行實驗得到MT的萃取率為81.69%，與理論值差別較小，測定MT體外清除羥自由基能力是VC溶液的3.1 倍，與文獻(xiàn)報道基本一致[25]。以上實驗結(jié)果充分驗證了所建模型的正確性，所以此優(yōu)化工藝條件是合理可行的。

3 結(jié) 論

雙水相萃取酵母源MT，在單因素的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken試驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析，確定雙水相萃取最佳工藝為PEG相對分子質(zhì)量2 000、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.5%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.46%、pH 5.98，常溫（25 ℃左右）進(jìn)行3 次萃取平行實驗，萃取率可達(dá)81.69%，與理論值81.87% 相差較小，MT體外清除羥自由基能力是VC溶液的3.1 倍，所以優(yōu)化后的工藝條件是可行的。本實驗嘗試了一種步驟簡單、快速、適宜工業(yè)化生產(chǎn)的提取MT的方法，對相關(guān)研究具有一定的參考價值。

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Optimization of Extraction Process of Yeast Metallothionein by Aqueous Two-Phase System

WANG Yue1, ZHANG Dongjie1,*, WANG Ying1,2,*, LIANG Xiaoyue1, XU Bingzheng1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China)

In this study, an aqueous two-phase system consisting of polyethylene glycol (PEG) and ammonium sulfate was used to extract copper-induced metallothionein (MT) from a mutant strain of Saccharomyces cerevisiae. Response surface methodology was employed to optimize three factors namely PEG concentration, (NH4)2SO4concentration and pH that influence extraction efficiency using the software Design-Expert 8.0.6. The optimal aqueous two-phase system for MT extraction was determined to contain 22.5% PEG 2 000, 17.46% (NH4)2SO4at pH 5.98. Under these optimal conditions, the metallothionein was mainly distributed in the upper phase with an extraction rate of 81.69%. Therefore, this method can provide a new, simple, convenient, economical and highly efficient strategy for the extraction of metallothionein from yeast.

metallothionein; aqueous two-phase system extraction; response surface methodology; distribution coefficient; extraction rate

TS201.1

A

10.7506/spkx1002-6630-201510011

2014-10-17

黑龍江省教育廳新世紀(jì)人才項目(2014-2016)；黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z13169)

王月(1990—),女,碩士研究生,研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：wangy426@126.com

*通信作者：張東杰(1966—),男,教授,博士,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程和食品質(zhì)量安全。E-mail：zdj_66@126.com

王穎(1979—),女,副教授,博士,研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及食品質(zhì)量與安全。E-mail：wychen156@163.com