陳軍華,周光明,秦紅英,程洪梅,沈 潔

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

翻白草中7 種黃酮和有機(jī)酸的超聲提取及含量測(cè)定

陳軍華,周光明*,秦紅英,程洪梅,沈 潔

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

目的：建立高效液相色譜法分離測(cè)定翻白草中綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素7 種成分的方法。方法：采用Phenomenex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分離7 種成分；流動(dòng)相為甲醇和pH 3的乙酸溶液,梯度洗脫；流速1.0 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm,柱溫40 ℃。結(jié)果：7 種成分在20 min內(nèi)均達(dá)到基線分離,線性關(guān)系良好(r＞0.999 5),平均回收率為84.61%～104.06%(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.77%,n=3)。結(jié)論：翻白草中7 種活性成分的最佳提取條件為80%甲醇溶液、固液比1∶50(g/mL)、超聲功率160 W、超聲時(shí)間20 min。實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果表明,翻白草中7 種活性成分的含量為：綠原酸121.5 μg/g、咖啡酸60.5 μg/g、金絲桃苷127.2 μg/g、槲皮素108.6 μg/g、柚皮素294.0 μg/g、山柰酚61.1 μg/g和芹菜素114.0 μg/g。

高效液相色譜；翻白草；黃酮類化合物；有機(jī)酸

翻白草(Potentilla discolor Bunge)為薔薇科植物翻白草的帶根全草,始載于《救荒本草》,其根肥厚,去皮色白,葉面青背白,故名翻白草。其味甘、微苦、性平,歸肝、胃大腸經(jīng),具有清熱解毒、涼血止血的功效,可用于治療肺熱咳喘、瀉痢、瘧疾、咳血、吐血、便血、崩漏、癰腫瘡毒等疾病[1]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于翻白草化學(xué)成分的研究[2-11]表明其主要成分為萜類、甾體、多酚類及黃酮類化合物。近幾年很多實(shí)驗(yàn)[12-19]表明翻白草中的黃酮類化合物具有降血糖、治療糖尿病等功效,其中黃酮類化合物主要有槲皮素、山柰酚、芹菜素、金絲桃苷和柚皮素[20]等。目前,鮮有關(guān)于翻白草中黃酮類化合物定量測(cè)定的報(bào)道,石磊等[21]采用索氏提取法提取并測(cè)定了翻白草中的總黃酮,但該提取方法繁瑣且耗時(shí)；劉思曼等[22]用反相高效液相色譜僅僅測(cè)定了其中的槲皮素和山柰酚,本實(shí)驗(yàn)首次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分離和測(cè)定其中的多種黃酮類化合物。另?yè)?jù)文獻(xiàn)[23-26]報(bào)道綠原酸和咖啡酸具有保護(hù)DNA活性和抗氧化等多種藥理作用,故本實(shí)驗(yàn)也對(duì)翻白草中的綠原酸和咖啡酸進(jìn)行了分離和測(cè)定。本研究以高效液相色譜-紫外檢測(cè)(high performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)法作為分離測(cè)定手段,采用超聲波提取法前處理樣品,實(shí)現(xiàn)對(duì)翻白草中5 種黃酮類化合物和2 種有機(jī)酸的分離及含量測(cè)定,以期為翻白草的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

翻白草購(gòu)于重慶藥房。

綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚、芹菜素對(duì)照品(純度均≥98.5%) 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；甲醇(色譜純)、乙酸(分析純) 重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；二次蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A HPLC儀(包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵) 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相B,乙酸(pH 3.0)為流動(dòng)相A,進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min,30%→57% B；5～10 min,57%→57% B；10～15 min,57%→30% B；15～20 min,30%→30% B)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：40 ℃。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品適量分別置于10 mL容量瓶中,甲醇溶解稀釋至刻度,得到質(zhì)量濃度分別為500、500、742、550、680、570、560 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別精確吸取綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和芹菜素對(duì)照品溶液0.8 mL和柚皮素對(duì)照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成混合對(duì)照品溶液,置于冰箱(4 ℃)內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 供試品溶液的制備

精確稱取干燥粉碎的翻白草粉末(60 目篩)0.1 g,加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶液,超聲(160 W, 4 kHz)萃取20 min,萃取液離心(3 500 r/min)10 min,取上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液,按1.3.1節(jié)條件測(cè)定混合對(duì)照品和樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合對(duì)照品和樣品的色譜圖

混合對(duì)照品和樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

比較乙腈-水、乙醇-水、甲醇-水、四氫呋喃-水作為流動(dòng)相的分離效果。用乙腈和乙醇分別與水作為流動(dòng)相時(shí),槲皮素和柚皮素的分離效果很差；四氫呋喃-水作為流動(dòng)相不能很好地分離山柰酚和芹菜素。當(dāng)用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)各物質(zhì)能夠彼此分離,但是綠原酸和咖啡酸的峰對(duì)稱性不好；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)了不同pH值的流動(dòng)相以改善峰形,當(dāng)用pH 3的乙酸溶液代替純水時(shí),乙酸能抑制綠原酸和咖啡酸的解離從而有效改善其峰的前延和拖尾。開(kāi)始嘗試用50%甲醇比例等度洗脫,7 種被測(cè)成分出峰時(shí)間太早,并且槲皮素和柚皮素以及山柰酚和芹菜素?zé)o法分開(kāi),逐漸減小甲醇比例,山柰酚和芹菜素勉強(qiáng)能夠分開(kāi),但是出峰時(shí)間太晚且峰形展寬嚴(yán)重。故最終選擇甲醇和pH 3的乙酸溶液作為流動(dòng)相按1.3.1節(jié)中的梯度洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫。

2.2.2 提取溶劑的選擇

比較甲醇、乙醇和環(huán)己烷3 種提取溶劑的提取效果,發(fā)現(xiàn)甲醇的提取量明顯高于另外2種溶劑,故選擇甲醇作為提取溶劑。同時(shí)進(jìn)一步考察不同比例的甲醇-水溶液對(duì)有效成分提取量的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。甲醇的體積分?jǐn)?shù)由60%增大至100%時(shí),柚皮素的提取量明顯增大,其余6 種被測(cè)成分的提取量變化比較平緩。

2.2.3 超聲時(shí)間和功率的影響

超聲萃取時(shí)間和功率是影響提取量的重要因素,實(shí)驗(yàn)比較了甲醇超聲10、20、30、40 min和50 min被測(cè)成分的提取量,結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),7 種被測(cè)成分的提取量不斷增大；超聲時(shí)間大于30 min后提取率增加不明顯。同時(shí)也考察了不同超聲提取功率對(duì)7 種被測(cè)成分提取量的影響。從圖4可以看出,超聲功率對(duì)各成分的提取量影響不是很大,在功率大于120 W時(shí),除了柚皮素的提取量不大外,其余各成分基本達(dá)到最大的提取量。

2.2.4 波長(zhǎng)和固液比的選擇

對(duì)比5 種黃酮類化合物在360 nm波長(zhǎng)處都有較強(qiáng)的紫外吸收,再結(jié)合綠原酸和咖啡酸的測(cè)定波長(zhǎng),綜合考慮后確定350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。比較固液比為1∶20、1∶30、1∶50、1∶80和1∶100(g/mL)的提取效果。圖5結(jié)果表明,不同成分隨固液比的變化趨勢(shì)不一樣,從1∶20～1∶100的變化中,綠原酸、金絲桃苷。柚皮素和芹菜素的提取量先增大后減小；另外3 種成分的提取量一直增大；在固液比為1∶50和1∶80的條件下,7 種成分的提取量相當(dāng)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化各參數(shù),其中主要考察甲醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、超聲時(shí)間和超聲功率4 個(gè)影響因素,各取3個(gè)水平。試驗(yàn)中利用7 種成分的總提取量來(lái)評(píng)價(jià)萃取性能。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表1。

從表1極差R可知,各因素對(duì)7 種成分總提取量的影響程度依次為A＞B＞D＞C,即甲醇體積分?jǐn)?shù)是影響總提取量的主要因素,固液比和超聲功率的影響次之,超聲時(shí)間的影響最小。比較k1、k2、k3的值可得提取7種成分的最佳條件為：A2B3C1D2,即甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶80、超聲時(shí)間20 min、超聲功率160 W。另外對(duì)比因素固液比的k2和k3的值發(fā)現(xiàn)兩者相差甚微(分別為685.500和688.567),即固液比為1∶50和1∶80的提取量相當(dāng),為了節(jié)約提取溶劑,選擇固液比為1∶50。故優(yōu)化最終條件為：A2B2C1D2,即甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、固液比1∶50、超聲時(shí)間20 min、超聲功率160 W。

2.3 線性關(guān)系考察

精確吸取1.3.2節(jié)混合對(duì)照品溶液,以甲醇逐步稀釋成7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。取不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液按質(zhì)量濃度由低到高依次進(jìn)樣20 μL,在1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(μg/mL)、峰面積為縱坐標(biāo)Y(10-3mV)進(jìn)行線性回歸。7 種被測(cè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 精密度

取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次,測(cè)定各個(gè)對(duì)照品的峰面積,結(jié)果綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為1.37%、1.86%、1.91%、2.38%、1.03%、1.50%、2.65%,表明儀器精確度良好。

2.5 穩(wěn)定性

精確吸取同一供試品溶液2 d內(nèi)每間隔4 h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的RSD分別為2.52%、2.19%、0.66%、1.49%、2.13%、2.08%、2.19%,表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性

取同批樣品粉末5 份,按1.3.3節(jié)制備供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素峰面積的RSD(n=5)分別為1.27%、2.50%、1.97%、2.01%、2.16%、1.60%、1.22%,表明儀器具有良好的重復(fù)性。

2.7 樣品的含量測(cè)定及回收率

稱取0.1 g樣品粉末3 份,按1.3.3節(jié)的方法制備供試品溶液,每份供試品溶液進(jìn)樣分析3 次,根據(jù)表2中對(duì)應(yīng)的線性方程計(jì)算樣品含量,結(jié)果見(jiàn)表3。稱取9 份翻白草樣品各0.1 g,分為3 組,每組按低、中、高分別加入一定量的對(duì)照品溶液,然后均依供試品制備方法、測(cè)定方法分析,每份重復(fù)進(jìn)樣3 次,計(jì)算平均回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC-UV法,實(shí)現(xiàn)了翻白草中綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和芹菜素7 種活性成分的同時(shí)分離及含量測(cè)定,取得了滿意的效果,實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果表明：翻白草中7 種活性成分的含量為綠原酸121.5 μg/g、咖啡酸60.5 μg/g、金絲桃苷127.2 μg/g、槲皮素108.6 μg/g、柚皮素294.0 μg/g、山柰酚61.1 μg/g和芹菜素114.0 μg/g。采用超聲萃取前處理樣品,方法快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。分別考察了不同流動(dòng)相、甲醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、超聲功率及時(shí)間對(duì)提取7 種被測(cè)成分的影響,優(yōu)化得到最佳提取條件,為藥用植物翻白草的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Ultrasonic Extraction and Determination of Seven Flavonoids and Organic Acids in Potentilla discolor Bunge

CHEN Junhua, ZHOU Guangming*, QIN Hongying, CHENG Hongmei, SHEN Jie
(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis (Southwest University), Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for separation and determination of chlorogenic acid, caffeic acid, hyperoside, quercetin, naringenin, kaempferol and apigenin in Potentilla discolor bunge. Methods: The separation of seven flavonoids and organic acids was performed on Phenomenex C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) with gradient elution. The mobile phase was a mixture of methanol and acetic acid (pH 3.0)at a flow rate of 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was 350 nm. Results: Baseline separation of chlorogenic acid, caffeic acid, hyperoside, quercetin, naringenin, kaempferol and apigenin was achieved within 20 min. The calibration curves of the seven components showed linear relationships (r ＞ 0.999 5). The average recoveries were in the range of 84.61%-104.06% with a relative standard deviation (RSD) of less than 4.77%. Conclusion: The optimal extraction conditions for seven flavonoids and organic acids from Potentilla discolor Bunge were determined as follows: ethanol concentration, 80%; solid-to-liquid ratio, 1:50 (g/mL); ultrasonication power, 160 W; and ultrasonication time, 20 min. One gram of Potentilla discolor Bunge contained 121.5 μg of chlorogenic acid, 60.5 μg of caffeic acid, 127.2 μg of hyperoside, 108.6 μg of quercetin, 294.0 μg of naringenin, 61.1 μg of kaempferol, and 114.0 μg of apigenin as determined by this method.

high performance liquid chromatography (HPLC); Potentilla discolor Bunge; flavonoids; organic acids

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201510019

2014-09-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21277110)

陳軍華(1989—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)樯V分析。E-mail：chenjunh999@163.com

*通信作者：周光明(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樯V及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn