孫婷婷,劉 曄,任占冬,朱玉嬋

(武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430023)

基于雙波長紫外吸收的乳脂肪快速測定

孫婷婷,劉 曄*,任占冬,朱玉嬋

(武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430023)

為便于實(shí)施對(duì)乳品加工中乳品及管路殘留乳脂肪含量的全面監(jiān)控，建立一種基于雙波長紫外吸收的乳脂肪快速定量方法。采用萃取-沉淀操作采集液態(tài)乳或加工管壁樣本中的乳脂肪并直接測定204 nm和230 nm 2 個(gè)波長處的吸光度，再基于吸光度差ΔA204nm-230nm和乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可確定樣本中的乳脂肪含量。對(duì)于液態(tài)乳品樣本，該方法的變異系數(shù)不大于3%，回收率在95.6%～102.9%之間，并可有效避免乳品熱處理差異的干擾。此外，該方法也可成功用于不同加工條件下乳品加工管路中乳脂肪管壁殘留量的測定。

乳脂肪；快速測定；紫外吸收；雙波長；熱處理

乳脂肪是決定乳品營養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)的關(guān)鍵組分之一，其含量是原料及制品的一項(xiàng)核心質(zhì)量指標(biāo)。而在乳品加工過程中，乳脂肪又是管路及設(shè)備壁面殘留物中的代表性化學(xué)成分，對(duì)于描述乳品加工系統(tǒng)的污染狀況或者清洗效果而言是重要指標(biāo)之一[1]。這意味著，對(duì)于乳脂肪含量的監(jiān)測并不局限于原料和制品，而是貫穿于整個(gè)乳品加工過程中的。因此，快速、準(zhǔn)確且通用的乳脂肪含量測定方法對(duì)于評(píng)價(jià)乳品品質(zhì)及保障加工過程的穩(wěn)定具有重要應(yīng)用價(jià)值[2-3]。

關(guān)于包括乳品在內(nèi)的食品脂肪含量測定，目前已報(bào)道的方法大體可分3 類:其一為質(zhì)量或容量法，包括索氏抽提法、哥特里-羅茲法、氯仿-甲醇法、蓋勃氏法以及巴布科克法等，作為各類食品脂肪定量的標(biāo)準(zhǔn)方法[3-8]，但操作繁瑣且靈敏度低。其二為光譜法，包括分光光度法、熒光光譜法以及（近）紅外光譜法等[9-14]，因靈敏度高而能對(duì)低濃度樣本準(zhǔn)確定量。但是，其中可見光分光光度法或者熒光法往往涉及脂質(zhì)的顯色或染色處理，影響因素多且操作繁瑣[10-11]；而（近）紅外光譜法雖快速便捷，但是涉及復(fù)雜的化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)處理和建模[12]。其三為色譜法，主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等，抗干擾能力強(qiáng)且能夠提供脂肪的化學(xué)組成信息[15-18]，但通常樣品處理繁瑣或設(shè)備要求高。此外，還有基于聲學(xué)的超聲波法和基于電化學(xué)的電子舌法用于脂肪測定的報(bào)道[19-20]，但均需基于可靠的標(biāo)準(zhǔn)測定方法才能建立定量化的模型?？梢姡趯?duì)各類乳品加工樣本和設(shè)備壁面殘留物中的乳脂肪實(shí)施頻繁監(jiān)測的場合下，現(xiàn)有方法均存在較大局限性?？紤]到在紫外區(qū)，乳脂肪本身即具有特定吸收信號(hào)，無需顯（染）色處理即可直接觀測，有利于建立快速簡便的操作過程；而且紫外光譜儀器裝備廣泛，故選擇基于乳脂肪紫外吸收特征的定量方法易于推廣應(yīng)用。為此在本研究中，基于乳脂肪本身的紫外吸收光譜特征建立簡便靈敏的定量方法，對(duì)于乳品樣本及加工管壁殘留的乳脂肪均可快速定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂乳（標(biāo)稱乳脂肪含量3.7 g/100 mL）、低脂乳（標(biāo)稱乳脂肪含量1.3 g/100 mL） 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；低脂乳（標(biāo)稱乳脂肪含量1.3 g/100 mL）伊利乳業(yè)股份有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-1集熱式磁力恒溫?cái)嚢杵?金壇市江南儀器廠；HZQ-2恒溫振蕩搖床、XH-C旋渦混合器 金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；SC-3614臺(tái)式離心機(jī)、HC-2064高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DA-968超聲波清洗儀 上海精密儀器儀表有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

本研究所用乳品加工管道模擬裝置如圖1所示。該裝置由外壁包覆硅橡膠電熱帶的250 mm×25 mm的304不銹鋼拋光管及恒溫控制部件構(gòu)成，其管道內(nèi)壁表面積146.35 mm2，可在35～150 ℃內(nèi)精確控溫。

1.3 方法

1.3.1 乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)液的制備

移取5 mL全脂乳置于50 mL離心管中,加入12 mL萃取劑(V(正庚烷)∶V(乙醇)=1∶1.4),再分別加入0.75 mL質(zhì)量濃度21.9 g/100 mL的乙酸鋅溶液和0.75 mL質(zhì)量濃度10.6 g/100 mL的亞鐵氰化鉀溶液,旋渦振蕩混合后置于10 000×g條件下離心10 min收集上清液,在上清液中加入無水硫酸鈉并靜置15 min。準(zhǔn)確移取一定體積的上清液經(jīng)氮?dú)獯祾呙撊芎笥?0 ℃條件下真空干燥至恒質(zhì)量,測定殘質(zhì)量以標(biāo)定上清液中乳脂肪質(zhì)量濃度。標(biāo)定后的上清液與稀釋劑(V(正庚烷)∶V(去離子水)∶V(乙醇)=1∶1∶1.4混合后靜置分層,所得上清液加無水硫酸鈉脫水)混合配制系列質(zhì)量濃度的溶液,即作為乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 樣本的稀釋和熱處理

將10 mL全脂乳在高速攪拌條件下注入90 mL去離子水，并在12 000 r/min條件下均質(zhì)90 s制備10 倍稀釋樣本。再以相同操作將上述10 倍稀釋樣本進(jìn)一步稀釋為100 倍稀釋樣本。

將0.2 mL全脂乳置于10 mL具塞離心管中，浸入設(shè)定溫度的甘油浴并持續(xù)攪拌加熱至設(shè)定時(shí)間后浸入20 ℃水浴中冷卻，所得樣本為熱處理樣本。

1.3.3 乳脂肪的快速測定

精確移取一定體積的樣本（全脂乳、低脂乳、稀釋樣本及熱處理樣本）于10 mL具塞離心管中，補(bǔ)充去離子水至2 mL，然后加入萃取劑（V（正庚烷）∶V（乙醇）= 1∶1.4）4.8 mL、質(zhì)量濃度21.9 g/100 mL的乙酸鋅溶液和質(zhì)量濃度10.6 g/100 mL的亞鐵氰化鉀溶液各0.34 mL，旋渦混合均勻后在10 000×g條件下離心5 min得上清液。再重復(fù)萃取操作2 次，合并上清液后以正庚烷定容至10 mL。定容的上清液置于石英比色皿中，以波長寬1.0 nm，200 nm/min的掃速采集波長200～350 nm范圍內(nèi)的吸收曲線。以所選定的雙波長吸光度差結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中乳脂肪含量。

1.3.4 管路殘留乳脂肪的采集和測定

將全脂乳在12 000 r/min條件下均質(zhì)90 s后，取60 mL分裝至各乳品加工管道模擬裝置中并密封，在設(shè)定溫度條件下以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩1 h。到達(dá)設(shè)定時(shí)間后將密封管段置于20 ℃水浴中冷卻，倒出液態(tài)乳并垂直放置于4 ℃冷藏箱中瀝干得到污染管。在污染管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%濃磷酸2 mL、蒸餾水6 mL和萃取劑（V（正庚烷）∶V（乙醇）=1∶1.4）14 mL，密閉后在50 ℃條件下以40 kHz超聲波振蕩萃取30 min（期間每5 min手動(dòng)翻轉(zhuǎn)一次）。將所得萃取液在10 000×g條件下離心5 min，收集上清液以無水硫酸鈉脫水后采集波長200～350 nm范圍內(nèi)的紫外吸收曲線。以所選雙波長吸光度差結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算管壁殘留乳脂肪量。

1.3.5 其他化學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理

乳脂肪的哥特里-羅茲法測定參照GB 5413.3—2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測定》[21]，乳脂肪的甘油氧化法測定參照文獻(xiàn)[10]。對(duì)于所有液態(tài)樣本的乳脂肪含量，做不少于3 次平行測定；對(duì)于管路污染及殘留乳脂肪測定，分別做3 次平行測定；對(duì)于顯著性分析，平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)不少于6 次并采用Microsoft Office Excel 2003做t-檢驗(yàn)及F-檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳脂肪的紫外吸收光譜特征

乳脂肪定量的首要步驟是將脂肪從樣本中萃取出來。為減少乳脂肪紫外吸收光譜采集過程中的干擾，在本研究中選擇紫外吸收較弱的正庚烷和乙醇混合萃取劑，并以乙酸鋅-亞鐵氰化鉀作為蛋白質(zhì)沉淀劑。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的操作組合和試劑用量，可高效萃取樣本中的乳脂肪并消除蛋白質(zhì)的干擾，所得萃取液可直接用于紫外吸收信號(hào)的采集。以全脂乳為樣本，經(jīng)歷不同條件熱處理后采集乳脂肪萃取物，在波長200～350 nm范圍內(nèi)直接掃描紫外吸收曲線，如圖2所示。

由圖2可知，乳脂肪在波長200～350 nm區(qū)間具有3 處較為明顯的吸收，其中波長204 nm附近的吸收主要由乳脂肪的酯鍵以及與之協(xié)同的烯鍵引起，而波長230 nm附近的吸收峰則主要由脂肪酸中的共軛雙鍵產(chǎn)生，波長268 nm附近的吸收通常歸因于脂肪酸中的三元共軛雙鍵[22]。而經(jīng)不同程度的熱處理后，乳脂肪紫外吸收峰的數(shù)量及位置基本上沒有變化，但隨著熱處理溫度的升高各波段吸收強(qiáng)度均略有上升，反映為吸收曲線的整體上移。需要說明的是，天然乳脂肪中僅存在少量的亞油酸和亞麻酸，而共軛脂肪酸就更為微量；但是經(jīng)熱處理后，烯鍵可發(fā)生遷移而共軛化或與酯鍵產(chǎn)生協(xié)同，因此能夠產(chǎn)生更顯著的紫外吸收[23]。以上現(xiàn)象表明，乳脂肪具有穩(wěn)定的紫外特征吸收信號(hào)，但是這些信號(hào)對(duì)熱處理較為敏感?？紤]到常規(guī)乳品加工溫度范圍往往在4～150 ℃之間，因此在采用上述特征信號(hào)建立乳脂肪定量方法時(shí)，需考慮消除熱處理對(duì)測定的干擾。

2.2 乳脂肪定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

乳脂肪在紫外區(qū)具有3 處穩(wěn)定的吸收峰，因此基于比爾-朗伯定律可望在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)建立乳脂肪質(zhì)量濃度和吸光度的定量關(guān)系。圖3羅列了一系列不同質(zhì)量濃度乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)液在波長200～350 nm范圍內(nèi)的光譜吸收曲線。

由圖3可知，系列質(zhì)量濃度乳脂肪的標(biāo)準(zhǔn)液在波長204、230、268 nm附近的光譜吸收強(qiáng)度均存在規(guī)律性的變化。其中，波長268 nm處吸收強(qiáng)度偏弱，若作為定量信號(hào)易導(dǎo)致測定靈敏度及精密度偏低。而對(duì)于消除熱處理?xiàng)l件對(duì)乳脂肪測定的干擾問題，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)采用雙波長法實(shí)施參數(shù)校正比較有效。圖4顯示了基于波長204 nm和波長230 nm吸光度差（表示為ΔA204nm-230nm）和乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4表明，在26～576 μg/mL范圍內(nèi)乳脂肪質(zhì)量濃度與ΔA204nm-230nm具有良好線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.992 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 3x+0.052 8。此外，該方法對(duì)液態(tài)乳樣本的最低檢測限為130 μg/mL（RSN＞3）。

2.3 方法的精密度和回收率

為驗(yàn)證雙波長紫外法（后簡稱紫外法）測定乳脂肪含量的精密度，對(duì)幾種商品化液態(tài)乳制品及系列稀釋樣本中的乳脂肪含量進(jìn)行測定。其結(jié)果與較為典型的重量法（哥特里-羅茲法）和可見光光譜法（甘油氧化法）測定對(duì)比，如表1所示。

由表1可知，當(dāng)待測樣本為全脂乳或低脂乳時(shí)，羅茲法、甘油氧化法和紫外法均可獲得較為可信的測定值，3 種方法的變異系數(shù)均在可接受范圍內(nèi)，其中紫外法具有較高的精密度。而在用于稀釋樣本測定時(shí)，羅茲法測定的變異系數(shù)顯著增大，對(duì)于100 倍稀釋樣變異系數(shù)高達(dá)31.4%，而同等條件下紫外法的變異系數(shù)仍控制在3%以內(nèi)；甘油氧化法靈敏度和精密度優(yōu)于羅茲法，但是該方法涉及皂化-氧化顯色操作，因操作繁瑣而易于引入誤差。上述結(jié)果表明，對(duì)于低質(zhì)量濃度乳脂肪樣本的測定，紫外法因靈敏度高且操作環(huán)節(jié)少而具有更高的精密度。需要說明的是，液態(tài)乳屬于不穩(wěn)定膠體體系，即使經(jīng)過良好的均質(zhì)處理也存在破乳化的傾向，而在稀釋時(shí)會(huì)因原有的穩(wěn)定乳化體系被破壞而導(dǎo)致較嚴(yán)重的離析行為。因此表1中稀釋樣本中乳脂肪含量與根據(jù)稀釋倍數(shù)反算的原樣含量并不相符，其主因是多次稀釋操作導(dǎo)致的樣本差異而并非測定誤差。

為進(jìn)一步驗(yàn)證雙波長紫外法測定對(duì)熱處理的抗干擾能力，對(duì)同一質(zhì)量濃度的全脂乳樣本實(shí)施熱處理，模擬因巴氏殺菌（典型條件75 ℃）和超高溫瞬間滅菌（典型條件137 ℃）而導(dǎo)致的乳脂肪變化，并將乳脂肪測定值分別與未經(jīng)熱處理的全脂乳進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，無論是經(jīng)歷75 ℃還是137 ℃熱處理的樣本乳脂肪測定值與未經(jīng)熱處理的樣本測定值均無顯著性差異（P＞0.05），而且多次測定的變異系數(shù)不大于3%。需要指出的是，本研究所采用的熱處理時(shí)間均大幅超過典型的乳品加工熱處理時(shí)間，意味著即便在實(shí)際加工過程中出現(xiàn)操作條件波動(dòng)而導(dǎo)致乳品品質(zhì)變化，也不影響上述無差異判斷。該結(jié)果表明，采用雙波長差校正可有效控制不同熱處理?xiàng)l件對(duì)乳脂肪測定的干擾，使該方法可通用于滅菌乳或殺菌乳制品。

為考證方法測定值的可信度，在全脂乳、低脂乳及稀釋樣本中添加乳脂肪標(biāo)準(zhǔn)液，并根據(jù)測定值和理論值計(jì)算乳脂肪回收率，結(jié)果如表3所示。

從表3可知，該方法對(duì)于各類樣本中乳脂肪回收率均在95.6%～102.9%之間，表明方法的可靠性較高，也應(yīng)證了本方法所采用的正庚烷-乙醇混合溶劑對(duì)乳脂肪萃取操作的高效性。

2.4 管路殘留乳脂肪的測定

在乳品加工過程中，包括乳脂肪在內(nèi)的多種化學(xué)成分往往沉積在管路內(nèi)壁面，導(dǎo)致管路流動(dòng)阻力上升及換熱性能下降，而且還易引起生物污染[24]。雖然目前乳品加工企業(yè)已經(jīng)廣泛采用原位清洗及拆卸清洗相結(jié)合的方式控制管路殘留物的過度積累，但是目前尚難以對(duì)管路殘留乳脂肪實(shí)施準(zhǔn)確定量，從而在清洗劑的優(yōu)選及清洗工藝的優(yōu)化方面缺乏可靠依據(jù)[25]。發(fā)展高靈敏度且操作便捷的紫外法乳脂肪測定方法，可為解決上述問題提供有效手段。在本研究中，首次利用雙波長紫外法測定典型加工溫度條件下乳品加工管路中乳脂肪的殘留量，其結(jié)果如圖5所示。

圖5顯示:在模擬常溫流動(dòng)、巴氏殺菌及超高溫滅菌乳品加工環(huán)節(jié)中，管壁乳脂肪在1 h后的殘留量。結(jié)果表明，在相同的加熱時(shí)間內(nèi)，乳品加工管內(nèi)壁的乳脂肪殘留量隨加熱溫度的升高而上升，溫度120 ℃條件下乳脂肪的管壁殘留量可達(dá)溫度75 ℃條件下同期殘留量3.4 倍以上，這一趨勢與乳品加工實(shí)踐相符。造成這一現(xiàn)象的原因在于，高溫條件下乳中的鈣和蛋白質(zhì)在管壁上的沉積速度顯著上升，導(dǎo)致管壁粗糙度上升，從而引起更多的乳脂肪被吸附或包裹在管壁殘留物中[25]。需要說明的是，為使測定值能正確反映管壁乳脂肪殘留量，在正庚烷-乙醇萃取劑中補(bǔ)加了磷酸以破壞鈣沉積物，并采用多輪萃?。ㄖ翜y定值低于方法檢測限）的方式以實(shí)現(xiàn)乳脂肪的徹底采集和定量。因此，本研究所報(bào)道的樣品處理系統(tǒng)及定量方法能有效應(yīng)用于乳品加工管路乳脂肪殘留量測定，若與熱加工時(shí)間相結(jié)合可用于研究管壁乳脂肪殘留物的形成動(dòng)力學(xué)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)提出并建立一種基于乳脂肪紫外吸收特征的雙波長紫外光譜定量方法，可用于各類乳品以及乳品加工管壁中乳脂肪含量的快速測定。該方法采用正庚烷-乙醇混合溶劑萃取樣本中的乳脂肪，并將萃取液直接用于紫外吸收光譜采集。以雙波長吸光度差ΔA204nm-230nm和乳脂肪質(zhì)量濃度建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 3x+0.052 8，線性相關(guān)系數(shù)為0.992 8；方法的檢測限為130 μg/mL，變異系數(shù)不大于3%，回收率在95.6%～102.9%之間。該方法操作簡單且靈敏度較高，尤其適用于低質(zhì)量濃度樣本的快速檢測。

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Rapid Determination of Milk Fat Based on Dual Wavelengths of Ultraviolet Absorption

SUN Tingting, LIU Ye*, REN Zhandong, ZHU Yuchan
(School of Chemical and Environmental Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

To facilitate the comprehensive monitoring of milk fat content in dairy products or pipeline residues throughout the dairy processing, a rapid assay for milk fat based on dual wavelengths of ultraviolet absorption was developed. Milk fat was recovered from samples of liquid dairy or dairy processing pipe wall with a extraction-precipitation operation and the absorbance at 204 nm and 230 nm of the milk fat extract was detected. The milk fat content could be calculated with the standard curve equation from the difference between absorbance at 204 nm and 230 nm. In this way, the interference of various heat treatments on samples could be avoided. It was verified that the variation coefficients were less than 3% and the recoveries ranged from 95.6% to 102.9% for liquid dairy samples. In addition, the method led to reliable results in determining milk fat residues in pipe wall under various dairy processing conditions.

milk fat; rapid determination; ultraviolet absorption; dual wavelength; heat treatment

TS252.42

A

10.7506/spkx1002-6630-201510020

2014-10-16

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101370)；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012FFB04803)

孫婷婷(1987—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)檠趸娢凰谌槠芳庸す艿狼逑粗械膽?yīng)用。

E-mail：suntingtingzc@126.com

*通信作者：劉曄(1974—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)生物質(zhì)資源的轉(zhuǎn)化及利用。E-mail：bioenergy@whpu.edu.cn