(遼寧省食品檢驗檢測院,遼寧 沈陽 110015)

熒光分光光度法測定營養(yǎng)素補充劑中硫胺素含量的測量不確定度評定

黃 旭,賈宏新,李 輝

(遼寧省食品檢驗檢測院,遼寧 沈陽 110015)

參照GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》測定營養(yǎng)液補充劑中硫胺素的含量。通過對測定過程中的不確定度來源進行分析，評定出各不確定度分量，最后計算出合成標準不確定度和擴展不確定度，結(jié)果表明:試樣中硫胺素含量為0.49 mg/100 g，擴展不確定度為0.052 mg/100 g。不確定度分量結(jié)果顯示，標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度在不確定度合成中貢獻最大，因此在營養(yǎng)素補充劑中硫胺素進行測定時，應(yīng)對標準曲線的擬合過程加強控制，確保結(jié)果的準確性。

不確定度；硫胺素；營養(yǎng)液補充劑

測量不確定度是表征合理的賦予被測量值的分散性，是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，一切測量過程都會不可避免地產(chǎn)生不確定度。測量不確定度就是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于其不確定度的大小。所以，測量結(jié)果表述必須同時包含賦予被測量的值及與該值相關(guān)的測量不確定度，才是完整并有意義的。檢測結(jié)果的不確定度反映了結(jié)果的可靠性，同時可以反映出檢測實驗室人員技術(shù)儀器設(shè)備的水平。

熒光分光光度法測定營養(yǎng)素補充劑中硫胺素含量的測量常用的方法，在其分析過程中操作步驟比較復(fù)雜，影響因素較多，因此給出具有置信概率的檢測結(jié)果，掌握對檢測結(jié)果有較大影響的關(guān)鍵因素，是實施內(nèi)部質(zhì)量控制的重要工作內(nèi)容。目前已經(jīng)出臺相關(guān)文件對校準實驗室測量不確定度的評估做出了要求[1-2]，現(xiàn)在許多實驗室已經(jīng)在檢測報告中提供測量結(jié)果的不確定度，以達到對檢測結(jié)果的進一步科學(xué)表述。本實驗根據(jù)GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》[3]對采用熒光分光光度法測定營養(yǎng)素補充劑中硫胺素含量過程中的不確定度來源進行全面分析，并最終給出評定結(jié)果，以找出對實驗結(jié)果影響較大的環(huán)節(jié)，它能對檢測數(shù)據(jù)進行客觀真實的評價，給出測量結(jié)果的可信程度[4]。測量結(jié)果的不確定度是評價一種測量方法能力優(yōu)劣的指征，并與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗用營養(yǎng)液補充劑為本實驗室某次檢驗的余樣，且樣品在保質(zhì)期內(nèi)，符合檢驗要求。

硫胺素（純度99.5%） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶（酶活度≥6 000 U） 杭州沃凱電氣有限公司；Taka淀粉酶（酶活度≥6 000U） 美國Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司；BS300S電子天平（精度為0.001 g） 德國Sartorius公司。

1.2 方法

本實驗參照GB/T 5009.84—2003[3]，對試樣中硫胺素的含量進行測定。

1.2.1 樣品處理

準確稱取一定量試樣（硫胺素含量約為10～30 μg，一般稱取2～10 g試樣），置于100 mL三角瓶中，加入50 mL 0.1 mol/L鹽酸使其溶解，置于沸水加熱1 h，涼后取出，冷卻。用2 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)pH值至4.5。按每克試樣加入20 mg淀粉酶和40 mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶，于45～50 ℃溫箱過夜保溫（約16 h）。冷卻至室溫，定容至100 mL，然后混勻過濾，即為樣品溶液。

1.2.2 氧化

將5 mL樣液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶中，在避光條件下，將3 mL質(zhì)量分數(shù)15%氫氧化鈉溶液加入反應(yīng)瓶A，作為樣品空白管。將3 mL堿性鐵氰化鉀溶液（0.7 g/L）加入反應(yīng)瓶B，作為樣品管，振搖約15 s，然后加入正丁醇10 mL，將A、B兩個反應(yīng)瓶同時用力振搖1.5 min。標準溶液同上操作。靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2～3 g無水硫酸鈉使溶液脫水。

1.2.3 熒光測定

激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長435 nm、激發(fā)波狹縫5 nm、發(fā)射波狹縫5 nm的條件下依次測定下列熒光強度:1）試樣空白熒光強度（試樣反應(yīng)瓶A）；2）標準空白熒光強度（標準反應(yīng)瓶A）；3）試樣熒光強度（試樣反應(yīng)瓶B）；4）標準熒光強度（標準反應(yīng)瓶B）。

熒光分光光度法測定食品中硫胺素(VB1)含量的計算公式為：

式中:x為試樣中硫胺素含量/（mg/100 g）；c為試樣被測液中硫胺素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為樣品定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；為試樣含量由μg/g換算成mg/100 g的系數(shù)。

1.2.4 不確定度來源因果圖（魚骨刺圖）

從測量模型上分析對食品中硫胺素含量的測量結(jié)果有影響的各種不確定度分量來源。各不確定度來源如圖2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度數(shù)學(xué)模型[5-13]

2.1.1 測量模型

式中:Y為試樣中硫胺素的質(zhì)量分數(shù)；m為樣品質(zhì)量；V1為樣品定容體積；C0為標準溶液；Cn為標準曲線擬合；S0為樣品空白；rep為測量重復(fù)性；Rec為回收率。

2.1.2 測量結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度

稱取樣品6 份，按照同樣測量過程進行平行測定:

2.1.3 樣品稱量引入的不確定度u（m）

式中:a為檢定證書其最大允許誤差；k為分布形態(tài)。

樣品稱量引入的相對標準不確定度:

2.1.4 樣品定容體積引入的不確定度u（V1）

式中:u（VA）為玻璃量器的容量允差；u（VC）為溫度變化產(chǎn)生的誤差。

樣品定容體積引入的相對標準不確定度:

2.1.5 標準溶液引入的不確定度

標準溶液引入的不確定度由標準物質(zhì)的不確定度u（Cs）和標準溶液配制過程引入的不確定度u（Cp）組成。

2.1.5.1 標準物質(zhì)的不確定度

2.1.5.2 標準溶液配制過程引入的不確定度u（Cp）

標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度為:

標準溶液引入的相對標準不確定度:

2.1.6 標準曲線擬合引入的不確定度u（Cn）

標準曲線剩余標準差:

式中:yi為標準溶液各濃度點對應(yīng)的響應(yīng)值；yj為根據(jù)標準曲線算出的理論響應(yīng)值；n為標準曲線的點數(shù)。

標準曲線擬合引入的不確定度:

式中:p為單一樣品溶液測量次數(shù)（2 次）；cd為單一待測樣品質(zhì)量濃度的平均值/（μg/mL）；cj為標準曲線各點質(zhì)量濃度理論值/（μg/mL）；為標準曲線各點質(zhì)量濃度的平均值/（μg/mL）。

標準曲線擬合引入的相對標準不確定度:

2.1.7 樣品空白引入的不確定度

樣品空白的標準不確定度:

樣品空白的相對標準不確定度:

2.1.8 回收率引入的不確定度u（Rec）

回收率的標準不確定度:

回收率的相對標準不確定度:

2.2 測量結(jié)果以及不確定度分析[14-26]

2.2.1 測量結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度

對同一樣品平行測定6 次（n=6），測得的結(jié)果分別為0.49、0.52、0.55、0.51、0.49、0.53 mg/100 g，測試結(jié)果的平均值為0.52 mg/100 g，測試結(jié)果的標準偏差為0.023 mg/100 g，測試結(jié)果的相對標準偏差為4.5%。

帶入公式（3），得出u(rep)=0.009 4 mg/100 g；帶入公式（4），得出urep(rep)=1.8%。

2.2.2 樣品稱量引入的不確定度u（m）

用分析天平稱取2.0 g樣品（m），精確到0.001 g，實際操作中采用精度為0.001 g的電子天平稱量，根據(jù)檢定證書其最大允許誤差為±0.000 5 g。樣品稱量是由一次回零稱量所得，且使用的是自動顯示數(shù)字的天平。

2.2.3 樣品定容體積引入的不確定度u（V1）

將處理后的樣品轉(zhuǎn)移至1 0 0 m L容量瓶中，100.0 mL A級容量瓶的標準不確定度包括玻璃量器的容量允差u（VA）和溫度變化產(chǎn)生的誤差u（VC）組成，JJG 196—2006[9]《常用玻璃量器》規(guī)定，20 ℃時100 mL容量瓶（A級）的容量最大允許誤差別為±0.10 mL按照均勻分布（k=），設(shè)溫度變化±3 ℃、水膨脹系數(shù)在20℃時，α= 2.1 × 10-4/℃。

帶入公式（7），得出u(V1)=0.068 mL；帶入公式（8），得出urep(V1)=0.068%。

2.2.4 標準溶液引入的不確定度

2.2.4.1 標準物質(zhì)的不確定度

硫胺素標準物質(zhì)證書上給出的相對不確定度U=0.50%，k=2。帶入公式（9），得出urep(C)=0.25%。

2.2.4.2 標準溶液配制過程引入的不確定度u（Cp）

標準溶液配制過程引入的不確定度由標準物質(zhì)稱量引入的不確定度u（m1）和稀釋定容過程引入的不確定度兩部分組成。

標準溶液儲備液配制:準確稱取100 mg經(jīng)氯化鈣干燥24 h的硫胺素，溶于0.01 mol/L鹽酸中，并稀釋至1 000 mL，配成0.1 mg/mL的標準儲備液。

標準使用液配制:取10.00 mL 0.1 mg/mL的標準儲備液稀釋至100.0 mL，配成10 μg/mL的標準中間液。取10.00 mL 10 μg/mL的標準中間液至100.00 mL，配成1 μg/mL的標準中間液。取0、1、5、10.00 mL 1 μg/mL的標準中間液至100.00 mL，配成0 μg/mL（標準使用液第1點）、0.01 μg/mL（標準使用液第2點）、0.05 μg/mL（標準使用液第3點）、0.1 μg/mL（標準使用液第4點）的標準使用液。取2、5 mL 10 μg/mL的標準中間液至100.00 mL，配成0.2 μg/mL（標準使用液第5點）、0.5 μg/mL（標準使用液第6點）的標準使用液。

以標準使用液第4點為例，標準溶液配制過程為:標準儲備液:C1=m1/V1；標準中間液:C2=V2×C1/V3；標準中間液:C3=V4×C2/V5；標準使用液:Cp=V6×C3/V7。

標準使用液配制過程最終表達式:

式中:V2為1 000 mL容量瓶，u（V容量瓶-1000mL）；V2、V4、V6為10.00 mL吸管，u（V吸管-10mL）；V3、V5、V7為100 mL容量瓶，u（V容量瓶-100mL）；第2、3、5、6點:分別用到1、5、2、5 mL分度吸管，100 mL容量瓶（4 次）。

（1）標準物質(zhì)稱量過程中分析天平最大允差

用分析天平稱取100 mg標準品，實際操作中使用精度為0.000 1 g的電子天平稱量，根據(jù)檢定證書其最大允許誤差為±0.000 5 g。樣品稱量是由一次回零稱量所得，且使用的是自動顯示數(shù)字的天平。

天平的最大允許誤差導(dǎo)致的相對標準不確定度:

（2）標準溶液逐級稀釋定容過程中玻璃量器的不確定度

使用玻璃量器:1 000 mL容量瓶1 次、100 mL容量瓶7次、10.00 mL單標線吸管3次、1 mL分度吸管1 次、2 mL分度吸管1 次、5 mL分度吸管2 次。

玻璃量器的不確定度包括玻璃量器的容量允差u（VA）和溫度變化產(chǎn)生的誤差u（VC）組成依據(jù)公式（7）計算。

以10 mL單標線吸管的不確定度為例:JJG 196—2006規(guī)定，20 ℃時10.00 mL單標線吸管（A級）的容量最大允許誤差為±0.020 mL。

10.00 mL單標線吸管引入的標準不確定度:

其中:

設(shè)溫度變化為±3 ℃，水膨脹系數(shù)在20 ℃時，α=2.1×10-4/℃。

10.00 mL單標線吸管引入的相對不確定度:

其他因素均查表，通過計算得出。

標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度帶入公式（10），得出:

標準溶液引入的相對標準不確定度:帶入公式

（11），得出urel（C0）=0.89%。

2.2.5 標準曲線擬合引入的不確定度u（Cn）

標準曲線擬合引入的標準不確定度:帶入公式（12）及（13），得出u（Cn）=0.003 3 μg/mL。

標準曲線擬合引入的相對標準不確定度:帶入公式（14），得出urel(Cn)=3.4%。

2.2.6 樣品空白引入的不確定度

平行做6 個樣品空白，不加樣品，其余操作同測量過程。樣品空白不確定度測定結(jié)果分別為9.4、9.3、10.3、 9.8、10.0、9.5，平均值標準偏差S（S0）=0.36；帶入公式（15），得出u（S0）=0.06；樣品空白的相對標準不確定度:帶入公式（16），得出ure（S0）=0.6%。

2.2.7 回收率引入的不確定度u（Rec）

稱取重復(fù)性樣品測定的樣品6 份，添加標準溶液，按照樣品測量過程進行平行測定，測定結(jié)果見表2。

帶入公式（17），得出u（Rec）=2.9%；帶入公式（18），得出urel（Rec）=3.1%。

2.3 計算相對合成標準不確定度和合成標準不確定度

相對合成標準不確定度為帶入下列公式,結(jié)果為：

試樣中硫胺素含量的測定結(jié)果平均值為0.52 mg/100 g，因此合成標準不確定度為:

2.4 擴展不確定度

按國際慣例，95%置信概率下取包含因子k=2，將合成標準不確定度乘以包含因子計算得到測量結(jié)果的擴展不確定度為:

2.5 報告測量結(jié)果

某一樣品測定熒光強度79.96 AU，樣品空白熒光強度9.51 AU，樣品定容體積100 mL，樣品的質(zhì)量為2.000 g。按照計算公式，則試樣中硫胺素的含量為 0.49 mg/100 g。測定結(jié)果報告為:（0.49±0.06）mg/100 g，k=2。

2.6 各分量不確定度匯總

以上測定各分量不確定度匯總表見表3。

檢驗結(jié)果的不確定度分別來自于測量結(jié)果重復(fù)性、樣品質(zhì)量、樣品定容體積等表3中所列出的7個分量。各個分量對不確定度的影響也有很大差別。從表3可以得出，標準曲線擬合、回收率對檢驗結(jié)果的不確定度影響最大，而此類分量也是實際檢驗過程中無法避免的，切實存在于系統(tǒng)誤差之中。

3 結(jié) 論

參照GB/T 5009.84—2003測定營養(yǎng)液補充劑中硫胺素的含量。通過對測定過程中的不確定度來源進行分析。本實驗測量過程中不確定度來源主要為人員的重復(fù)測定、標準曲線的擬合以及回收率，其中標準曲線擬合在不確定度合成中產(chǎn)生的貢獻最大。在今后的類似檢測過程中均應(yīng)對標準曲線的擬合過程加強質(zhì)量控制。

[1] 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計量司組. 測量不確定度評定與表示指南[M].北京: 中國計量出版社, 2005: 1-25.

[2] 國家標準化管理委員會. JJF 1059.1—2012 測量不確定度評定與表示[S]. 北京: 中國標準出版社, 2012.

[3] 國家標準化管理委員會. GB/T 5009.84—2003 食品中硫胺素(維生素B1)的測定方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2003.

[4] 劉智敏, 劉風(fēng). 現(xiàn)代不確定度方法與應(yīng)用[M]. 北京: 中國計量出版社, 1997: 40-51.

[5] 倪曉麗. 化學(xué)分析測量不確定度評定指南[M]. 北京: 中國計量出版社, 2008: 58-67.

[6] 李慎安. 測量不確定度表達百問[M]. 北京: 中國計量出版社, 2000: 99-104.

[7] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規(guī)程[S].北京: 中國計量出版社, 2007.

[8] 中國合格評定國家認可委員會. CNAS-CL07: 2011 測量不確定度的要求[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011.

[9] 李安. 質(zhì)檢測量中不確定度評定[J]. 誤差與不確定度, 2005(8): 67-68.

[10] 臧慕文. 分析測試不確定度的評定與表示[J]. 分析試驗室, 2005, 24(12): 85-90.

[11] 曹宏燕. 分析測試中測量不確定度及評定第三部分: 分析測試中主要不確定度分量的評定[J]. 冶金分析, 2005, 25(3): 82-87.

[12] 王承忠. 測量不確定度原理及在理化檢驗中的應(yīng)用[J]. 理化檢驗:物理分冊, 2003, 39(1): 57-60.

[13] 衛(wèi)生部. GB 2760—2011 食品添加劑使用標準[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011.

[14] 蔡秋, 朱明. 高效液相色譜法測定茶飲料中苯甲酸結(jié)果不確定度評定[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(2): 277-280.

[15] 崔淑華, 郭慶龍, 劉冰. 液相色譜法測定雞肉中二氯二甲吡啶酚殘留量的測量不確定度評定[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(12): 397-400.

[16] 楊秀培, 肖丹, 山桂云. 白酒中己酸乙酯測定的不確定度評估[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(7): 214-217.

[17] 丁明, 屈明華, 韓素芳. 液相色譜測定茶油中維生素E結(jié)果的不確定度評定[J]. 中國糧油學(xué)報, 2008, 23(5): 190-193.

[18] 張淑霞, 魯慧芳, 高亞輝. GC-MS-MS法測定濃縮蘋果汁中對硫磷殘留量的不確定度評定[J]. 糧油加工, 2010(10): 153-156.

[19] 吳小松, 劉沐雨, 曹玉發(fā), 等. HPLC法測定嬰兒配方奶粉中維生素A含量的不確定度評定[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(9): 309-311.

[20] 劉征輝, 趙琳琳, 魏靜娜, 等. LC-MS/MS法測定奶粉中三聚氰胺的不確定度評定[J]. 現(xiàn)代測量與實驗室管理, 2012(2): 23-24; 52.

[21] 霍艷敏, 王艷麗, 王駿, 等. 高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評定[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(16): 330-333.

[22] 張寶華. 熒光分光光度計檢定結(jié)果的不確定度評定[J]. 河北化工, 2010(4): 69-73.

[23] 鄭懷東, 劉學(xué)光, 關(guān)麗. 氣相色譜法測定河蟹中多氯聯(lián)苯殘留量的不確定度分析[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(16): 334-337.

[24] 牛華, 牛之瑞, 馮雷. 梅高效液相色譜法測定辣椒粉中羅丹明B的測量不確定度評估[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(8): 165-168. doi:10.7506/ spkx1002-6630-201408033

[25] 郝曉莉, 趙瑛博, 陳芳芳. 分光光度法測定白菜中亞硝酸鹽的不確定度評定[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(6): 208-210.

[26] 張素娟. 氣相色譜法測定白酒中乙酸乙酯含量的不確定度分析[J].食品科學(xué), 2010, 31(2): 151-153.

Evaluation of the Uncertainty of Measurement for Determination of Thiamine Content in Nutritional Supplements by Fluorescence Spectrophotometry

HUANG Xu, JIA Hongxin, LI Hui
(Liaoning Institute for Food Inspection and Testing, Shenyang 110015, China)

In this study, the thiamine (vitamin B1) content of nutritional supplements was determined according to the Chinese national standard GB/T 5009.84—2003: Determination of Thiamine (Vitamin B1) in Foods. By analyzing the sources of uncertainty in the determination of thiamine, we obtained the uncertainty components and finally calculated the combined standard uncertainty and expanded uncertainty. The results showed that thiamine content in the sample was 0.49 mg/100 g, and the expanded uncertainty was 0.052 mg/100 g. The uncertainty of standard curve fitting was the most important component of the combined standard uncertainty. Therefore, more attention should be paid to standard curve fitting in order to obtain more accurate results for the determination of thiamine in nutritional supplements.

uncertainty; thiamine; nutritional supplements

TS207.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510035

2014-04-23

黃旭(1982—),男,工程師,學(xué)士,研究方向為食品檢驗。E-mail：41856453@126.com