許可成，魏小紅，趙 萌，劉文瑜

(甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州730070)

麻花秦艽(Gentiana stramine)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)多年生草本植物，是我國重要的藏藥材資源之一，主要有清熱利膽、舒筋止痛、祛風濕之功效［1］。長期以來，受制于有限的耕地、種植條件等因素，在麻花秦艽栽培種植過程中存在著嚴重的“連作障礙”，植株常出現(xiàn)生長發(fā)育不良，品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度下降，病蟲害加?。?-3］，在天然草地上通?？梢娐榛ㄇ剀闯蓡我蝗郝渖L現(xiàn)象，這些現(xiàn)象可能與其化感作用有關(guān)。

化感作用一般指的是某種植物的地上或者地下部分通過向其生長環(huán)境中釋放一些化學活性物質(zhì)(即化感物質(zhì))，進而直接或間接影響到周圍其他植物(受體植物)的生長和發(fā)育，可在種間或種內(nèi)進行［4-7］。植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是其化感物質(zhì)的主要來源［8-10］。具有藥用價值的植物其體內(nèi)基本都含有特殊的藥用化學物質(zhì)，這些化學物質(zhì)比較容易釋放到周圍環(huán)境中［11-13］。所以，藥用植物更易產(chǎn)生化感物質(zhì)，一般具有較強的化感作用，但麻花秦艽化感作用一直缺乏研究。因此，本研究采用室內(nèi)生物測定方法，以代表性豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa)和禾本科小麥(Triticum aestivum)為受體植物，通過分析麻花秦艽葉和根的水浸提液對兩種受體植物種子萌發(fā)、幼苗生長的影響，探討麻花秦艽化感作用強弱和受體植物與麻花秦艽輪作緩解其連作障礙的可能性，為深入研究和利用麻花秦艽次生代謝產(chǎn)物以及尋找適宜的輪作植物建立合理的栽培制度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 自然概況與樣品采集

該試驗所用麻花秦艽采集于青藏高原邊緣的東祁連山金強河地區(qū)，采集地位于102°29' －102°23'E，37°11' －37°13' N。該地區(qū)海拔2 970 m，氣候寒冷潮濕，空氣稀薄，太陽輻射強，年均溫0.1 ℃;野生植物有120 d 左右的生長期;年日照時數(shù)2 600 h，年降水量416 mm 。

供試植物麻花秦艽于2012 年9 月，采集于多年圍欄封育草地，為生長3 年以上處于果實成熟期的野生麻花秦艽。挖取整株植株帶回實驗室，把根與葉分離，洗凈，自然風干后粉碎，過0.42 mm 篩后貯藏。

受體植物:紫花苜蓿(阿爾岡金號)為多年生豆科牧草，抗逆性強、適應性廣，為優(yōu)良牧草;春小麥(隴春30 號)為一年生禾本科糧食作物，適應性較廣。兩者在麻花秦艽栽培地均有種植，其種子購于甘肅省農(nóng)業(yè)科學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 麻花秦艽不同部位浸提液的制備 參照李俊和劉增文［14］的方法，有改動。將自然風干的麻花秦艽根、葉分別稱取100 g，加入500 mL 滅菌蒸餾水，在室溫下(20 ～24 ℃)浸泡48 h(期間每隔12 h搖動5 min)，將浸提液先用定量濾紙過濾，再用濾元單位為0.45 μm 的微孔濾膜過濾，用滅菌蒸餾水對過濾所得浸提液定容，再經(jīng)3 次消毒處理后得到不含微生物(濃度為0.2 g·mL－1)的麻花秦艽浸提液母液，于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆茫脮r按體積比稀釋至0.1、0.05 和0.025 g·mL－1。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗 采用培養(yǎng)皿濾紙法［15］，挑選紫花苜蓿和小麥種子，用0.1% HgCl2溶液對受體植物種子消毒3 ～5 min，無菌蒸餾水對消毒后的種子反復多次沖洗后均勻置于培養(yǎng)皿中(預先墊有雙層濾紙，濾紙和培養(yǎng)皿提前做無菌處理)，每皿50粒，每個培養(yǎng)皿分別加入不同濃度麻花秦艽葉和根的浸提液15 mL，對照加入15 mL 無菌蒸餾水，每個處理組3 次重復。將所有培養(yǎng)皿用保鮮膜包好，防止水分散失和交叉污染，然后置于(25 ±1)℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在12 h 光照/12 h 黑暗的條件下進行培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程中確保加濕器正常工作。每天統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)，統(tǒng)計試驗結(jié)束的標記是以持續(xù)3 d 不再有新受體植物種子發(fā)芽，計算種子最終發(fā)芽率、發(fā)芽勢(4 d)和發(fā)芽指數(shù)［14］。

1.2.3 幼苗生長和保護酶系統(tǒng)有關(guān)指標測定 受體植物幼苗培養(yǎng):參照張志忠等［16］的方法，對受體植物種子進行消毒處理，常溫催芽后均勻置于培養(yǎng)皿中(每皿50 粒)，再加入各濃度浸提液5 mL，之后每3 d 加1 次浸提液，以保證其濃度。用無菌蒸餾水處理作對照，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(25 ±1)℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照4 000 lx。每隔24 h 觀察幼苗生長狀況，7 d 后取樣，用于幼苗苗高、根長和鮮重的測定。幼苗苗高和根長用直尺測量，植株鮮重用電子分析天平直接稱重。繼續(xù)將幼苗培養(yǎng)3 d 后，進行各項生理指標測定。

參照陳建勛和王曉峰［17］的方法，分別測定受體植物幼苗中過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 各項試驗均重復3 次，所得數(shù)據(jù)用Excel 2007 軟件求得平均值和標準差，采用SPSS 軟件對不同處理進行單因素方差分析，采用Duncan 檢驗法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻花秦艽水浸提液對紫花苜蓿和小麥種子萌發(fā)的影響

不同濃度麻花秦艽葉的水浸提液處理都抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)，并且這種抑制作用與浸提液濃度呈正比。根的水浸提液處理下，除低濃度(0.025 g·mL－1)對紫花苜蓿發(fā)芽率和發(fā)芽勢有一定的促進作用外，其余也均為抑制，且與對照差異顯著(P ＜0.05)。麻花秦艽葉和根的水浸提液處理下，小麥種子萌發(fā)均受到不同程度的抑制?？傮w來看，相同濃度下葉的水浸提液較根的水浸提液對紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用強;相比小麥種子萌發(fā)，葉和根的水浸提液對紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用較強(表1)。

2.2 麻花秦艽水浸提液對紫花苜蓿和小麥幼苗生長的影響

不同濃度麻花秦艽葉和根的水浸提液對紫花苜蓿和小麥幼苗生長的影響表現(xiàn)出很大的差異(圖1)。其中葉的水浸提液對兩種受體植物幼苗生長的3 個指標都表現(xiàn)一定的抑制作用，較高濃度(0.05和0.1 g·mL )處理與對照相比大多差異顯著(P＜0.05)。而根的水浸提液處理下，0.025 g·mL－1時對紫花苜蓿幼苗生長則表現(xiàn)促進作用，但與對照相比差異不顯著(P ＞0.05)，而其他濃度處理下均為抑制作用。麻花秦艽葉和根的水浸提液對受體植物幼苗生長的影響與對種子萌發(fā)的影響基本一致。

圖1 不同濃度麻花秦艽浸提液處理下的紫花苜蓿和小麥幼苗生長相關(guān)指標Fig.1 Growth of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from Gentiana stramine

2.3 麻花秦艽水浸提液對紫花苜蓿和小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

麻花秦艽水浸提液對受體植物幼苗葉片中3 種抗氧化酶活性的影響不同(圖2)。其中，與對照相比，隨著麻花秦艽葉和根的水浸提液濃度的增大，SOD 和POD 活性變化總體上呈現(xiàn)升高的趨勢。但0.025 g·mL－1葉的水浸提液處理下，紫花苜蓿葉片SOD 活性變化最大，說明此濃度下誘導使其活性快速增強，清除自由基的危害。而其他浸提液濃度處理下SOD 和POD 活性都是在0.1 g·mL－1時達到最大值。

CAT 活性變化比較復雜，隨著葉的水浸提液濃度的升高，紫花苜蓿葉片CAT 活性呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢;而小麥先增大，但最高濃度0.1 g·mL－1時卻比對照顯著降低(P ＜0.05)。隨著根的水浸提液濃度的升高，紫花苜蓿葉片CAT活性持續(xù)升高;而小麥葉片CAT 活性總體也升高，在最高濃 度0. 1 g·mL－1時 反 而 比 中 間 濃 度0. 05 g·mL－1低。

圖2 不同濃度麻花秦艽浸提液處理下的紫花苜蓿和小麥幼苗的抗氧化酶活性Fig.2 The antioxidant enzyme activity of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from Gentiana stramine

2.4 麻花秦艽水浸提液對紫花苜蓿和小麥幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

隨著浸提液濃度的增加，MDA 含量均持續(xù)升高(圖3)。0.1 g·mL 根的水浸提液處理使紫花苜蓿和小麥MDA 含量分別比對照增加了90. 31%、23.14%。而葉的水浸提液處理下，當浸提液濃度達到0.1 g·mL－1時，與對照相比，紫花苜蓿和小麥MDA 含量分別增加了137%、73%，呈顯著性差異(P ＜0.05)。

圖3 不同濃度麻花秦艽浸提液處理下紫花苜蓿和小麥幼苗的MDA 含量變化Fig.3 The MDA content of alfalfa and wheat seedlings treated with different concentration of extracts from G. straminea

3 討論

種子萌發(fā)在植物生活史中起著基礎性作用，同時植物種子萌發(fā)和幼苗生長初期更易受到外界環(huán)境變化的影響，因此，種子萌發(fā)和幼苗生長狀況常作為植物的抗逆性評價標志。一般而言，外界脅迫效應越強，對受體植物所產(chǎn)生的抑制作用就越強，但不同受體植物對這種外界脅迫通常會表現(xiàn)出差異性［18-19］。在本研究中，兩種受體植物對同一濃度麻花秦艽浸提液脅迫的反應并不一致。相比較而言，禾本科小麥所受到的抑制作用較豆科紫花苜蓿弱的多，可能是麻花秦艽浸提液中所含的化感活性物質(zhì)對紫花苜蓿的脅迫效應更強，也可能與兩者種子結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。麻花秦艽對小麥的抑制作用較弱，可以用于麻花秦艽輪作體系，緩解其連作障礙，這可能也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將小麥用于麻花秦艽倒茬的原因所在。

植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT 等抗氧化酶可以抵御和清除活性氧，抑制膜質(zhì)過氧化，通常在維持植物細胞中的活性自由基處于較低水平有特殊作用。一般外界環(huán)境脅迫會使植物的抗氧化酶系統(tǒng)受到影響，在極短的時間內(nèi)誘導活性氧的爆發(fā)，降低植物清除自由基的能力，使其抗性減弱，從而導致植物細胞損傷，生長受到抑制，植物體內(nèi)抗氧化酶活性也會在脅迫下發(fā)生相應的變化［20-23］。MDA 是植物膜質(zhì)過氧化的重要代謝產(chǎn)物，膜質(zhì)過氧化損傷程度可以用MDA 含量進行衡量。同時，MDA 本身被認為是有毒物質(zhì)，其能與植物細胞內(nèi)某些化學成分發(fā)生了強烈的互相作用，造成植物膜系統(tǒng)受損，膜功能被破壞［24］。本研究中，低濃度0.025 g·mL－1葉的水浸提液處理時，紫花苜蓿體內(nèi)SOD、CAT 活性變化較大，可能是紫花苜蓿對浸提液的脅迫比較敏感，可以迅速誘導體內(nèi)酶活性升高。而其他濃度浸提液處理下，紫花苜蓿和小麥幼苗SOD、POD、CAT 活性的總體變化趨勢也都是升高，說明在麻花秦艽浸提液脅迫下，受體植物幼苗產(chǎn)生生理響應，啟動了抗氧化酶體系，使幼苗體內(nèi)抗氧化能力增強，加速了體內(nèi)自由基清除速率，阻止膜質(zhì)過氧化。但與此同時對植物細胞有害物質(zhì)MDA 的含量上升，使受體植物正常的生長代謝活動受到影響。

近年來，藥用植物自毒作用及對其他植物生長的化感作用引起了越來越多學者的關(guān)注，已對多種藥用植物的化感作用進行了研究［10，25-28］。在自然生態(tài)環(huán)境中，當土壤中的化感物質(zhì)累積到一定量后，就會通過延長種子發(fā)芽時間、降低發(fā)芽速率和抑制幼苗生長等影響植物生長［1］。本研究證實，麻花秦艽葉和根的水浸提液對兩種受體植物種子萌發(fā)和幼苗生長都有一定程度的抑制，并且隨著浸提液濃度的增加，這種抑制作用逐步增強。在麻花秦艽栽培過程中，可能將化感物質(zhì)釋放進土壤，不僅對自身的連作產(chǎn)生影響，對后茬作物生長也有一定程度的危害。對麻花秦艽的化學成分分析表明，其體內(nèi)主要含有龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物，還含有苦參酮、苦參酚等黃酮類化合物以及有機酸等［29-31］。而黃酮類物質(zhì)和有機酸現(xiàn)已被證實有很多為化感物質(zhì)［25］，麻花秦艽對受體植物的抑制作用是否由這些活性物質(zhì)導致，還有待進一步研究證實。同時由于本研究所用浸提液濃度相對較大，除了化感作用外，是否由滲透勢引起也有待后續(xù)繼續(xù)研究。

本研究僅在實驗室條件下分析了中草藥麻花秦艽葉和根的水浸提液的化感作用，結(jié)果表明麻花秦艽水浸提液對受體植物紫花苜蓿和小麥種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)出不同的抑制作用，受體植物細胞內(nèi)抗氧化酶活性的不同變化可能是其抑制作用的重要生理機制。這種抑制作用可能是由于麻花秦艽中所含化感物質(zhì)引起，但由于化感物質(zhì)作用的復雜性以及浸提液滲透勢的干擾，同時室內(nèi)試驗避免了外界自然條件多種因素的干擾，因此麻花秦艽化感作用特點和自然條件下麻花秦艽對其他植物的化感作用是否和本研究所得結(jié)果一致，還需要進一步研究。如果證實麻花秦艽存在明顯化感作用，就可以利用麻花秦艽化感物質(zhì)對不同植物作用效果不同的特點，建立作物和麻花秦艽的間、套及輪作制度，緩解或克服麻花秦艽連作障礙，為麻花秦艽合理栽培制度的建立和更好地利用這一藥用植物資源提供理論依據(jù)。

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