韓亞楠，吳瓊，高睿，馬淼，2，趙紅艷

( 1. 石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003; 2. 石河子大學甘草研究所，新疆石河子832003;3. 新疆師范大學圖書館，新疆烏魯木齊830054)

烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)隸屬于豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)［1］。以根和根狀莖入藥，是《中國藥典》中藥用甘草的主要品種［2］，具有抑菌［3］、消炎［4］、清熱解毒［5］、止咳［6］、解痙［7］、清除自由基［8］、抗輻射［9］、抗癌［10］和免疫調(diào)節(jié)［11-13］等多種功效，是中國傳統(tǒng)的中藥材，素有“十方九草”和“中藥國老”之美譽［14］，而且還廣泛應用于食品、飲料、釀造、煙草及日用化工等領域。近年來，在經(jīng)濟利益和資源需求增加的驅(qū)動下，我國野生甘草資源遭到無節(jié)制的采挖，使得野生資源已遠不能滿足社會需求，因此，人工種植甘草已成必然趨勢。然而，自然條件下，甘草需生長3 ～4 年后方可采挖銷售，與當年就可采收獲利的糧棉作物相比，農(nóng)戶更傾向于用良田種植一年生作物，從而嚴重制約了其在現(xiàn)有農(nóng)田中的大面積種植推廣。

新疆是我國甘草的主產(chǎn)區(qū)，也是我國甘草的道地性產(chǎn)區(qū)，新疆甘草種類豐富，品質(zhì)優(yōu)異，備受市場青睞。由于遠離海洋的內(nèi)陸環(huán)境和干旱的大陸性氣候，新疆成為全國土壤鹽漬化大區(qū)，新疆鹽堿土地面積大、種類多，被稱為世界鹽堿土的“博物館”［15］。新疆鹽漬化耕地中的80%屬次生鹽漬化［16］，因此，新疆的鹽堿地面積還有進一步擴大的可能。甘草具有抗寒、耐旱、耐鹽堿的優(yōu)良特性［17-18］，如能利用新疆廣袤的閑置鹽堿荒漠發(fā)展甘草種植業(yè)，不僅有利于當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的修復和改善，而且可以激發(fā)農(nóng)戶的種植積極性。然而，在鹽堿脅迫下，種子萌發(fā)是決定植物能否成功建植和生長的關鍵階段。因此，探尋提高甘草種子在高鹽環(huán)境下的耐受性對其在鹽堿地大面積種植具有重要意義。

輻射誘變育種因具有突變率高、突變譜寬、后代性狀穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點［19］，已成為獲得新種質(zhì)資源的有效途徑之一。60Co-γ 輻射作為一種重要的輻射手段，為我國的輻射育種作出了重大貢獻。目前，60Co-γ 輻射在提高植物的耐鹽性方面已有報道［20-21］，但關于輻射后的烏拉爾甘草的耐鹽性鮮有報道。因此，利用輻照誘變技術(shù)培育對鹽堿環(huán)境具有較強耐受性的甘草種質(zhì)是實現(xiàn)烏拉爾甘草在鹽堿脅迫條件下種植的重要途徑，不僅有助于發(fā)展荒漠經(jīng)濟，而且有助于鹽堿土退化植被的生態(tài)恢復。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種子于2013 年采自新疆維吾爾自治區(qū)巴州輪臺縣，置于4 ℃冰箱中保存。2014 年3 月20日進行種子萌發(fā)試驗，種子千粒重為8.86 g。

1.2 試驗設計

挑選飽滿的烏拉爾甘草種子，用98% 的濃H2SO4處理1 h，自來水反復沖洗至無硫酸殘留，晾干。將晾干的種子封裝后送往新疆農(nóng)業(yè)科學院輻照中心進行60Co-γ 射線輻射處理，輻射劑量分別為0、50、100、150、200、250、300 Gy，劑 量 率 為2. 75 Gy·min－1。輻照后分別置于不同濃度的Na2SO4單鹽溶液中浸泡24 h。Na2SO4濃度分別為0、80、160、200、240、280、320、360、400 mmol·L－1，試驗以未輻射種子和蒸餾水處理為對照(CK)，共63 個處理。

將經(jīng)過預處理的種子均勻地擺放于鋪有兩層濾紙的透明萌發(fā)盒內(nèi)，加入25 mL 相應濃度的Na2SO4鹽溶液(與預處理浸種時的鹽溶液濃度一致)，將萌發(fā)盒置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，光照12 h·d－1，光照強度為450 μmol·m－2·s－1)中培養(yǎng)。每處理30粒種子，設3 個重復，每天補充一次蒸餾水以保證各鹽濃度在種子萌發(fā)過程中保持恒定。每隔24 h 統(tǒng)計種子的萌發(fā)情況(以胚根突出種皮2 mm 為標準)，統(tǒng)計7 d。

1.3 測定指標

選取發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)作為耐鹽性的評價指標。

式中，Gt為t 天發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 軟件進行方差分析，WPS 表格作圖。

2 結(jié)果與分析

雙因素方差分析表明，劑量輻射、Na2SO4濃度及其互作均極顯著影響烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率(P=0.000)(表1)。

在蒸餾水處理組(0 mmol·L－1Na2SO4)，100和300 Gy 的輻照處理均顯著提高種子的發(fā)芽率(P ＜0. 05)，較 無 輻 照 處 理 分 別 提 高 了12% 和17.34%;150 Gy 的輻照處理則顯著抑制了種子的萌發(fā)，使發(fā)芽率降低了12%;其他處理與對照間差異不顯著(P ＞0.05)(圖1);所有處理組的累積發(fā)芽率在2 d 后均趨于穩(wěn)定(圖2)。由此可見，不同劑量的輻照處理對烏拉爾甘草種子的萌發(fā)能力產(chǎn)生了不同的影響效果。在80 mmol·L－1Na2SO4脅迫下，50 Gy 的輻射顯著地抑制烏拉爾甘草種子發(fā)芽，使發(fā)芽率降低了33.79%，其他劑量的處理與對照間差異不顯著(圖1);所有處理組的累積發(fā)芽率則在3 d 后趨于穩(wěn)定(圖2)。在160 mmol·L－1Na2SO4脅迫下，100 Gy 和300 Gy 的輻射下發(fā)芽率顯著提高，較對照分別提高了20.63%和23.81%，其他劑量的處理與對照間差異不顯著(圖1);累積發(fā)芽率結(jié)果表明，除250 Gy 的發(fā)芽率在6 d 后趨于穩(wěn)定以外，其他輻照處理組的累積發(fā)芽率在4 d 后趨于穩(wěn)定(圖2)。隨著鹽濃度的進一步升高(200 ～320 mmol·L－1)，對照組和處理組種子的發(fā)芽率開始下降，但輻照處理組的下降幅度明顯低于對照組，表現(xiàn)出較強的耐鹽性，其中100 Gy 劑量輻射處理的種子作用效果最好;在360 mmol·L－1Na2SO4脅迫下，除200 Gy 和250 Gy 的處理發(fā)芽率低于對照以外，其他劑量的輻射均不同程度地促進了烏拉爾甘草種子的發(fā)芽;當Na2SO4溶液濃度增加到400 mmol·L－1時，只有經(jīng)100 Gy 輻照處理的烏拉爾甘草種子能夠發(fā)芽(圖1)。累積發(fā)芽率結(jié)果表明，在200 mmol·L－1Na2SO4脅迫下，所有處理的發(fā)芽率在4 ～6 d 后趨于穩(wěn)定。在240 ～400 mmol·L－1Na2SO4脅迫下，所有劑量輻照處理組的累積發(fā)芽率都高于對照，發(fā)芽時間延遲，并且在7 d 時還都有不同程度的增加(圖2)。由此可見，特定劑量的輻照處理可以提高甘草種子在不同濃度Na2SO4溶液中的耐鹽性能。隨著Na2SO4濃度的升高，所有處理組的發(fā)芽指數(shù)整體呈下降的趨勢，但100 Gy 和300 Gy 劑量輻照處理的種子的發(fā)芽指數(shù)明顯高于對照組，說明100 Gy和300 Gy 劑量輻照處理有助于提高甘草種子的發(fā)芽速度(圖3)。

表1 輻射劑量和鹽濃度對烏拉爾甘草種子發(fā)芽率影響的方差分析結(jié)果Table 1 Effects of radiation dose and salt concentration on germination percentage of Glycyrrhiza uralensis seeds

圖1 不同劑量60Co-γ 輻射對烏拉爾甘草種子萌發(fā)階段耐鹽能力的影響Fig.1 Effects of different 60 Co-γ radiation doses and different Na2 SO4 concentration on germination percentage of Glycyrrhiza uralensis seeds

圖2 60Co-γ 輻射對Na2 SO4 脅迫下烏拉爾甘草種子累積發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of 60 Co-γ radiation on accumulated germination percentage of Glycyrrhiza uralensis seed under Na2 SO4 stress treatments

圖3 60 Co-γ 輻射對Na2SO4 脅迫下烏拉爾甘草種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.3 Effects of 60 Co-γ radiation on seed germination index of Glycyrrhiza uralensis under different Na2SO4 stress treatments

3 討論與結(jié)論

種子植物的生長發(fā)育要經(jīng)歷種子發(fā)芽、營養(yǎng)生長及生殖生長3 個時期。種子發(fā)芽和幼苗生長是鹽生植物生活史中對土壤鹽分十分敏感而關鍵的階段。在鹽漬環(huán)境中，種子能夠發(fā)芽是植株在鹽堿脅迫下能夠生長發(fā)育的前提。種子耐鹽能力和發(fā)芽能力影響著植物種群的分布范圍［22］。鹽脅迫下的種子發(fā)芽狀況是評價植物耐鹽性的一個重要指標。

發(fā)芽指數(shù)是衡量種子發(fā)芽速度快慢的參數(shù)。本研究表明，Na2SO4脅迫對烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)有顯著影響，且隨著鹽濃度的增加種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢。低濃度的Na2SO4脅迫對烏拉爾甘草種子發(fā)芽的抑制作用不顯著，但隨著鹽濃度的上升，抑制程度加劇。主要表現(xiàn)在，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)降低，初始發(fā)芽時間推遲，種子發(fā)芽時間延長，這與前人的研究結(jié)果一致［23］。其中，高濃度的鹽溶液對種子發(fā)芽率的影響最為強烈，可能是由于高鹽脅迫已超出烏拉爾甘草種子的耐受閾值，破壞了細胞質(zhì)膜的完整性，導致細胞選擇透性下降，使細胞內(nèi)離子毒害加劇，造成部分種子的永久性失活［24］，或高鹽脅迫增加了溶液的滲透勢，使種子吸水困難，造成細胞內(nèi)水分虧缺，進而抑制種子萌發(fā)［25］。但經(jīng)60Co-γ 輻照處理的烏拉爾甘草種子在高鹽環(huán)境中的發(fā)芽率顯著高于非輻照組，100 Gy 和300 Gy 劑量輻照處理有助于提高甘草種子的發(fā)芽速度。說明輻射處理提高了烏拉爾甘草對高鹽環(huán)境的耐受能力，這可能是輻射引起了種子內(nèi)部生物自由基或有關酶活性的變化，從而提高了種子的新陳代謝水平，促進了種子的萌發(fā)［26］。

綜上，隨著鹽脅迫濃度的增加，烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)降低，不同劑量的輻射處理之間表現(xiàn)出較大差異。隨發(fā)芽時間的延長，各濃度鹽處理下種子累積發(fā)芽率的變化趨勢一致，均呈現(xiàn)逐漸增大，并最終趨于穩(wěn)定的變化格局，鹽濃度越高，發(fā)芽率趨于穩(wěn)定的時間就越長，種子萌發(fā)的遲滯效應就越明顯。不同劑量輻射處理的種子發(fā)芽起始時間和發(fā)芽高峰期的時間均出現(xiàn)推遲，但經(jīng)100 Gy 輻照處理的種子在整個Na2SO4脅迫梯度(0 ～400 mmol·L－1)中表現(xiàn)出較好的耐性，并且100 Gy 和300 Gy 劑量輻照處理有助于提高甘草種子的發(fā)芽速度。

本研究僅比較研究了經(jīng)60Co-γ 輻照處理的烏拉爾甘草種子在Na2SO4脅迫環(huán)境下種子發(fā)芽階段的耐鹽性能，而輻射處理對烏拉爾甘草幼苗耐鹽能力的影響以及經(jīng)輻照處理的烏拉爾甘草對不同鹽分環(huán)境的耐受性能還有待進一步探討。

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會編.中國植物志 第四十二卷 第二分冊［M］.北京:科學出版社，1998:167-176.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:59-63.

［3］ Gafner S，Bergeron C，Villinski J R，Godejohann M，Kessler P，Cardellina J H，F(xiàn)erreira D，F(xiàn)eghali K，Grenier D.Isoflavonoids and coumarins from Glycyrrhiza uralensis:Antibacterial activity against oral pathogens and conversion of isoflavans into isoflavan-quinones during purification［J］.Journal of Natural Products，2011，74(12):2514-2519.

［4］ Kolbe L，Eggers K，Immeyer J，Wensorra U，Neufang U.Anti-oxidative and anti-inflammatory properties of licochalcone A from Glycyrrhiza inflata on human skin in vitro and in vivo［J］.Journal of Investigative Dernatology，2007，127(2):71.

［5］ Kwon H J，Kim H H，Ryu Y B，Kim J H，Jeong H J，Lee S W，Chang J S，Cho K O，Rho M C，Park S J.In vitro anti-rotavirus activity of polyphenol compounds isolated from the roots of Glycyrrhiza uralensis［J］.Bioorganic and Medicinal Chemistry，2010，18(21):7668-7674.

［6］ Saha S，Nosal＇ova G，Ghosh D，F(xiàn)leskova D，Capek P，Ray B.Structural features and in vivo antitussive activity of the water extracted polymer from Glycyrrhiza glabra［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(4):634-638.

［7］ Yazdi A，Sardari S，Sayyah M，Ezzati M H.Evaluation of the anticonvulsant activity of the leaves of Glycyrrhiza glabra var. glandulifera grown in Iran，as a possible renewable source for anticonvulsant compounds［J］.Iranian Journal of Pharmaceutical Research，2011，10(1):75-81.

［8］ Khattak K F，Simpson T J.Effect of gamma irradiation on the antimicrobial and free radical scavenging activities of Glycyrrhiza glabra root［J］.Radiation Physics and Chemistry，2010，79(4):507-512.

［9］ Shetty T K，Satav J G，Nair C K K.Protection of DNA and microsomal membranes in vitro by Glycyrrhiza glabra L.against gamma irradiation［J］.Phytotherapy Research，2002，16(6):576-578.

［10］ Hwang J H，Suh H J，Yu K W.Immunostimulating and anticancer activities of hot-water extracts from Acanthopanax senticosus and Glycyrrhiza uralensis［J］.Food Science and Biotechnology，2008，17(6):1185-1190.

［11］ Wang J J，Chen X Q.Glycyrrhizic acid as the antiviral component of Glycyrrhiza uralensis Fisch against coxsackievirus A16 and enterovirus 71 of hand foot and mouth disease［J］.Journal of Ethnopharmacology，2013，147(1):114-121.

［12］ Cakmak Y S，Aktumsek A，Duran A.Studies on antioxidant activity，volatile compound and fatty acid composition of different parts of Glycyrrhiza echinata L.［J］.Excli Journal，2012，11:178-187.

［13］ Kuang P H，Zhao W X，Su W X.18 beta-glycyrrhetinic acid inhibits hepatocellular carcinoma development by reversing hepatic stellate cell-mediated immunosuppression in mice［J］.International Journal of Cancer，2013，132(8):1831-1841.

［14］ 余茜，趙紅艷，馬淼.激素對光果甘草愈傷組織總黃酮含量的影響［J］.石河子大學學報，2011，29(4):416-419.

［15］ 中國科學院新疆綜合考察隊，中國科學院土壤研究所.新疆土壤地理［M］.北京:科學出版社，1965:429.

［16］ 田長彥，周宏飛，劉國慶.21 世紀新疆土壤鹽漬化調(diào)控與農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展研究建議［J］.干旱區(qū)地理，2000，23(2):177-180.

［17］ 趙則海，楊逢建，曹建國，祖元剛.野生與栽培烏拉爾甘草不同部位甘草酸含量分析［J］.植物研究，2005，25(4):444-448.

［18］ 萬春陽，王丹，侯俊玲，王文全，李衛(wèi)東.氯化鈉脅迫對甘草生長、生理及有效成分含量的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(18):118-121.

［19］ 賈彩鳳，李艾蓮.我國藥用植物輻射誘變育種的研究進展［J］.中草藥，2007，38(4):633.

［20］ 楊宇，李東，張乾.60Co-γ 輻射對馬鈴薯耐鹽愈傷組織誘導的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(12):6140-6141.

［21］ 賈玉芳，陳曙，柴明良.γ 射線對溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生和耐鹽性的影響［J］.草業(yè)學報，2010，19(5):25-30.

［22］ 王磊，嚴成，魏巖，尹林克.溫度、鹽分和儲藏時間對多花檉柳種子萌發(fā)的影響［J］.干旱區(qū)研究，2007，25(6):797-801.

［23］ 胡生榮，高永，武飛，米志英，張雨.鹽脅迫對兩種無芒雀麥種子萌發(fā)的影響［J］.植物生態(tài)學報，2007，31(3):513-520.

［24］ 盧艷敏.不同鹽脅迫對高羊茅種子萌發(fā)的影響［J］.草業(yè)科學，2012，29(7):1088-1093.

［25］ 渠曉霞，黃振英.鹽生植物種子萌發(fā)對環(huán)境的適應對策［J］.生態(tài)學報，2005，25(9):2389-2398.

［26］ 朱宗文，查丁石，朱為民，郭世榮，朱龍英.60Co-γ 射線輻射對番茄種子萌發(fā)及早期幼苗生長的影響［J］. 種子，2010，29(8):15-22.