王歡歡， 呂雅瑤， 彭 博， 錢小紅， 張養(yǎng)軍*

（1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530021；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

細(xì)胞色素P450 （CYP）酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移（UGT）酶在內(nèi)源或外源化合物的Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝中起著重要作用。人肝微粒體中的Ⅰ相藥物代謝酶主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A4 等；Ⅱ相藥物代謝酶主要包括UGT1A1、UGT1A2、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B10、UGT2B11、UGT2B15等。已有很多文獻(xiàn)［1，2］報(bào)道CYP 和UGT 酶的表達(dá)水平具有較大的個(gè)體差異性。這些藥物代謝酶含量的不同導(dǎo)致藥物對(duì)不同個(gè)體具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)行為，直接影響藥效和藥物的安全性。例如，波立維（氯吡格雷）是一種用于治療動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的藥物，該藥只有經(jīng)過肝臟中CYP2C19藥物代謝酶的代謝才具有活性。由于不同病人中CYP2C19 藥物代謝酶表達(dá)量不同，波立維對(duì)不同病人的治療效果迥異，即對(duì)一些病人效果良好，但對(duì)其他人沒有療效。另外，不僅在化學(xué)合成藥物研究領(lǐng)域，在中藥研究領(lǐng)域也有許多研究者開展了藥物代謝酶的相關(guān)研究［3-6］。正是由于藥物代謝酶表達(dá)量對(duì)藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用的極端重要性，已發(fā)展了多種用于藥物代謝酶含量的測定方法，主要包括：蛋白質(zhì)印跡（Western blot）方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（RT-PCR）方法、探針?biāo)幬锓ê透咝б合嗌V-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（HPLC-MRM MS）方法。

1979 年，Towbin 等［7］發(fā)展了Western blot 方法，并將其用于復(fù)雜生物樣本中特定蛋白質(zhì)的鑒定。該方法已經(jīng)在生物化學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用。例如，Western blot 方法被用于人類免疫缺陷病毒（HIV）、萊姆病（Lyme disease）、乙型肝炎（Hepatitis B）等疾病的檢測。另外，Western blot 方法也被較早用于藥物代謝酶含量的測定。雖然Western blot 方法具有較高的靈敏度和較大的應(yīng)用范圍，但用于藥物代謝酶定量時(shí)存在4 個(gè)關(guān)鍵性的問題：（1）藥物代謝酶具有高序列同源性，難以制備特異性抗體；（2）具有半定量的特點(diǎn)；（3）線性范圍較窄；（4）分析通量低，即分析樣本數(shù)量有限。這些缺點(diǎn)限制了該方法的廣泛使用。例如，Shimada 等［8］在1994 年應(yīng)用該方法對(duì)60 例樣本的CYP 藥物代謝酶進(jìn)行定量時(shí)，由于缺乏特異性抗體，只能得到3A 和2C 家族的總量，無法分別獲得3A4、3A5 和2C9、2C19 的含量信息。

RT-PCR 是一種可迅速且準(zhǔn)確地對(duì)多種生物系統(tǒng)的基因表達(dá)進(jìn)行定量的方法，廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA 的含量［9］。這種方法定量結(jié)果的準(zhǔn)確性主要決定于：（1）RNA 的完整性；（2）cDNA 的合成效率；（3）內(nèi)參基因［10-12］。隨著分子生物學(xué)、克隆技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，一些藥物代謝酶的表達(dá)水平可以通過mRNA 的水平進(jìn)行測定［13-16］。RT-PCR 方法的優(yōu)點(diǎn)是具有高選擇性和高靈敏度，但由于其檢測對(duì)象是mRNA，而mRNA 翻譯到蛋白質(zhì)的表達(dá)過程還受多種因素調(diào)控。因此，對(duì)mRNA 定量并不能準(zhǔn)確表示mRNA 翻譯到蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

探針?biāo)幬锓ㄊ峭ㄟ^比較探針?biāo)幬锱c經(jīng)藥物代謝酶代謝的產(chǎn)物的濃度比或探針?biāo)幬锏那宄蕘砗饬棵傅拇x能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)藥物代謝酶的活性進(jìn)行定量測定的一種方法。通過HPLC 及LC-MS 的方法可以測定藥物探針的代謝物，探針?biāo)幬锓ㄒ呀?jīng)廣泛用于藥物代謝酶活性的測定［17-21］。為了增加分析通量，多種探針?biāo)幬镌趩未卧囼?yàn)中可同時(shí)用于多種藥物代謝酶的活性測定，并稱之為雞尾酒法（cocktail approach）［22］。探針?biāo)幬锓ǖ膬?yōu)點(diǎn)是既考慮了基因因素又考慮了環(huán)境因素對(duì)藥物代謝酶活性的影響，但其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，分析周期長，底物有交叉現(xiàn)象，很難找到專一性化學(xué)探針?biāo)幬铩?/p>

HPLC-MRM MS 方法是一種用于生物樣本中蛋白質(zhì)絕對(duì)定量的常用技術(shù)。在應(yīng)用這種技術(shù)時(shí)，首先將樣本中所有目標(biāo)蛋白質(zhì)水解成肽段，然后通過液相色譜對(duì)酶切肽段進(jìn)行分離，再通過離子源將分離的餾分離子化后進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)入質(zhì)譜的離子具有不同的質(zhì)荷比，經(jīng)過第一級(jí)質(zhì)量過濾器Q1選擇具有特定質(zhì)荷比的母離子，被選擇的母離子進(jìn)入碰撞誘導(dǎo)池（CID）中，并在CID 中通過碰撞誘導(dǎo)碎裂形成碎片離子，碎片離子經(jīng)過第二級(jí)質(zhì)量過濾器Q3 后，被選擇的子離子到達(dá)質(zhì)譜檢測器［23］。目前，HPLC-MRM MS 方法因其高靈敏度、高選擇性和高通量的特點(diǎn)，加之不需要特異性的抗體，已經(jīng)成為藥物代謝酶定量分析的常用方法［24-27］。為此，我們重點(diǎn)評(píng)述該方法的研究進(jìn)展。

1 化學(xué)合成法制備內(nèi)標(biāo)肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對(duì)定量方法

采用化學(xué)合成方法合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段，是基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對(duì)定量方法中較早采用的一種制備內(nèi)標(biāo)肽段的方法。這種方法是在化學(xué)合成過程中，將穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸作為原料引入到內(nèi)標(biāo)肽段，然后將這些穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段加入到待測樣本酶切液中作為內(nèi)標(biāo)，通過這些輕標(biāo)肽段與相應(yīng)的重標(biāo)肽段的峰面積比進(jìn)行定量。例如，F(xiàn)allon 等［26］采用穩(wěn)定同位素稀釋-多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（SID-MRM MS）方法對(duì)9 例人肝微粒體樣本中的UGT1A1 和UGT1A6 兩種藥物代謝酶進(jìn)行絕對(duì)定量時(shí)，首先化學(xué)合成了這兩種藥物代謝酶的特異性肽段，其中化學(xué)合成的肽段T78YPVPF（13C9，15N）QR85和D70GAF （13C9，15N）YTLK77用于對(duì)UGT1A1 酶進(jìn)行定量；化學(xué)合成的肽段D44IVEV（13C5，15N）LSDR52、S103FLTAP（13C5，15N）QTEYR113和I77YPVP（13C5，15N）YDQEELK88用于對(duì)UGT1A3 酶進(jìn)行定量，基于這種方法對(duì)UGT1A1 酶的定量結(jié)果與Western blot 方法的定量結(jié)果具有良好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r ＝0.988）；Kawakami 等［27］也采用化學(xué)合成法制備了重標(biāo)肽段作為內(nèi)標(biāo)，用SID-MRM MS 方法對(duì)10 例人肝微粒體樣本中的11 種CYP 酶進(jìn)行了絕對(duì)定量，發(fā)現(xiàn)CYP1A2、2A6、2C19 和3A4 的表達(dá)水平具有20 多倍的個(gè)體差異性；Ohtsuki 等［28］采用相同的內(nèi)標(biāo)制備方法，用SID-MRM MS 對(duì)17 例樣本中的20 種CYP 和UGT 酶進(jìn)行絕對(duì)定量，揭示了CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4、CYP2A6、UGT1A6、UGT2B7 和UGT2B15 的表達(dá)水平大于50 fmol／μg，并且分析了藥物代謝酶的表達(dá)水平與藥物代謝酶的活性以及mRNA 的表達(dá)水平的相關(guān)性；Liu 等［29］采用化學(xué)合成制備內(nèi)標(biāo)肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法和藥物探針法對(duì)12 例人肝微粒體樣本的7 種CYP 藥物代謝酶進(jìn)行了定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CYP3A4 酶的表達(dá)水平與酶活性具有較高相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r ＝0.943，p＜0.000 1）；Gr?er 等［30］采用以上方法對(duì)25 例人肝微粒體樣本中的9 種CYP 酶和4 種UGT酶進(jìn)行了絕對(duì)定量，揭示了藥物代謝酶表達(dá)水平之間的相關(guān)性。雖然基于化學(xué)合成法制備內(nèi)標(biāo)肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法可以對(duì)藥物代謝酶含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定，但由于通過化學(xué)合成方法制備內(nèi)標(biāo)肽段過程復(fù)雜、耗時(shí)耗力且需要對(duì)每條內(nèi)標(biāo)肽段進(jìn)行準(zhǔn)確定量，不適合用于藥物代謝酶的高通量、規(guī)?；糠治?。因此，迫切需要發(fā)展一種規(guī)?；苽鋬?nèi)標(biāo)肽段的方法。

2 基于定量肽段串聯(lián)體蛋白質(zhì)（Qcon-CATs）技術(shù)制備內(nèi)標(biāo)肽段結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶絕對(duì)定量方法

規(guī)模化制備內(nèi)標(biāo)肽段對(duì)于藥物代謝酶含量的高通量測定至關(guān)重要，為此，Beynon 等［31］在2005 年成功設(shè)計(jì)、表達(dá)了一種人工合成蛋白質(zhì)，這種人工合成蛋白質(zhì)是多個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)酶切后的特異性肽段的串聯(lián)體，即將編碼QconCAT 蛋白質(zhì)的基因序列插入到高表達(dá)的質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，制備QconCAT 蛋白質(zhì)。由于在QconCAT蛋白質(zhì)中所有目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性肽段都以等摩爾比關(guān)系存在，因此只要QconCAT 蛋白質(zhì)中一條特異性肽段被準(zhǔn)確定量，便可知其他特異性肽段的含量。鑒于QconCAT 技術(shù)制備內(nèi)標(biāo)肽段的優(yōu)點(diǎn)，Achour 等［32］首次將QconCAT 制備技術(shù)應(yīng)用到藥物代謝酶的定量中，通過與MRM MS 方法結(jié)合對(duì)24 例樣本中的13 種CYP 酶和8 種UGT 酶同時(shí)進(jìn)行含量測定，揭示了藥物代謝酶表達(dá)水平之間的相關(guān)性，并分析了年齡、吸煙、酒精對(duì)藥物代謝酶表達(dá)水平的影響，為藥物代謝酶的規(guī)?；块_辟了新的途徑。另外，我們課題組的Li 等［33］也將Qcon-CAT 技術(shù)與18O 酶促反應(yīng)標(biāo)記結(jié)合制備內(nèi)標(biāo)肽段并應(yīng)用到藥物代謝酶的含量測定，這種方法縮短了制備樣品的時(shí)間，可對(duì)人肝微粒體中的21 種藥物代謝酶進(jìn)行同時(shí)定量。盡管如此，QconCAT 技術(shù)制備內(nèi)標(biāo)肽段也存在一些問題，例如部分內(nèi)標(biāo)肽段不完全標(biāo)記，以及QconCAT 制備的內(nèi)標(biāo)肽段以相同的物質(zhì)的量加入到待測樣本中，對(duì)樣本中豐度差異較低的藥物代謝酶準(zhǔn)確定量產(chǎn)生不利的影響。

3 基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的藥物代謝酶的相對(duì)定量方法

穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）是蛋白質(zhì)組學(xué)中一種常用的代謝標(biāo)記技術(shù)，即在含有重標(biāo)氨基酸的培養(yǎng)液中，通過代謝途徑對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記的技術(shù)［34］。由于該方法具有高準(zhǔn)確度，MacLeod 等［35］在傳統(tǒng)SILAC 標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過同步配體介導(dǎo)的多個(gè)上游核受體的激活誘導(dǎo)藥物代謝酶的表達(dá)，使用目標(biāo)高分辨-選擇性監(jiān)測質(zhì)譜（tHR-SIM MS）方法對(duì)鼠肝中68 種Ⅰ相代謝酶和30 種Ⅱ相代謝酶進(jìn)行了相對(duì)定量。特別是在這種方法中，通過同步配體介導(dǎo)方法誘導(dǎo)藥物代謝酶高表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cyps 1a、2a、2b、2c 和3a 等表達(dá)水平較低的藥物代謝酶準(zhǔn)確定量，這種方法為接近檢出限或定量限的低表達(dá)藥物代謝酶的準(zhǔn)確定量，提供了一種新的研究思路。

4 HPLC-MRM MS 方法中降低基體干擾影響的方法

HPLC-MRM MS 方法應(yīng)用于小分子的定量分析中，被分析物與基體是容易分離的［36，37］。但當(dāng)這些方法用于復(fù)雜生物大分子樣本中藥物代謝酶（蛋白質(zhì)）的定量時(shí)，首先需要對(duì)生物樣本中所有蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，然后通過對(duì)不同藥物代謝酶特異性的肽段進(jìn)行定量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該藥物代謝酶的定量。因此，這些方法面臨的一個(gè)共同挑戰(zhàn)是，由于不同肽段構(gòu)成的基體與被分析物肽段的化學(xué)性質(zhì)相近，使得分析物難以分離，這些基體將與目標(biāo)肽段共同通過ESI 離子源進(jìn)入質(zhì)譜，影響被分析物的檢出限、定量限、線性范圍以及定量準(zhǔn)確度［38］。另外，一些藥物代謝酶，如CYP2C19、UGT1A3，以及UGT2B11等含量較低的藥物代謝酶在質(zhì)譜中的信號(hào)較低，且受到基質(zhì)干擾的影響而無法檢測。因此，在HPLCMRM MS 方法建立和性能評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)充分考慮基體干擾問題。常用的方法是采用空白基體消除其對(duì)分析結(jié)果的影響，但在一種樣本中定量多種分析物時(shí)，難以獲得空白基體。雖然有文獻(xiàn)［39-42］報(bào)道采用外源基體作為空白基體降低基體干擾的影響，但由于與實(shí)際樣本基體有較大差異，因此，這種方法的作用影響有限。為此，發(fā)展了一些新的降低基體干擾影響的方法。我們課題組的Zhao 等［43］將樣本中存在的高濃度蛋白質(zhì)的混合物作為空白基體，盡管與真實(shí)樣本基體較接近，但仍有一定差距。Wang 等［44］采用金屬元素多重標(biāo)記合成肽段作為內(nèi)標(biāo)，采用實(shí)際樣本作為基體，可解決基體干擾問題。但是由于該方法標(biāo)記過程復(fù)雜，不利于實(shí)際應(yīng)用。Kuzyk等［45］將樣本溶液進(jìn)行一系列的稀釋，配制成不同濃度的樣本，然后加入等量的標(biāo)記肽段，經(jīng)過HPLCMRM MS 分析，根據(jù)樣本中被分析物與標(biāo)記肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算出樣本中待測物的濃度。雖然該方法考慮了基體干擾，但采用單點(diǎn)校正法計(jì)算樣本中藥物代謝酶的濃度，不僅計(jì)算方法會(huì)導(dǎo)致分析物濃度測定值與真實(shí)值之間的偏差，且經(jīng)稀釋的不同濃度點(diǎn)的樣本基體濃度不同，也會(huì)使分析結(jié)果的精密度變差。綜上所述，雖然用于復(fù)雜生物樣本中藥物代謝酶含量測定的方法研究取得了很大的進(jìn)展，但更高靈敏度、更高準(zhǔn)確度和更高通量的藥物代謝酶定量新方法仍然需要進(jìn)一步探索。

5 結(jié)語

綜上所述，在藥物代謝酶含量測定的方法中，HPLC-MRM MS 方法具有高靈敏度、高選擇性和高通量的特點(diǎn)，加之不需要特異性的抗體，與其他經(jīng)典方法相比具有更多優(yōu)勢；但這種方法的應(yīng)用也面臨一些問題，如低濃度的藥物代謝酶因受基體干擾影響定量準(zhǔn)確性和空白樣本基體制備問題、規(guī)模化內(nèi)標(biāo)制備問題以及如何進(jìn)一步提高液相色譜分離度、質(zhì)譜的檢測靈敏度和通量的問題。這些問題都對(duì)HPLC-MRM MS 方法在藥物代謝酶定量中的應(yīng)用造成困難，需要逐步解決并開發(fā)出藥物代謝酶定量的新方法。

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