朱麗萍，陸瑤，胡國(guó)元*，劉啟燕

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.武漢如意食用菌生物高科技有限公司，湖北 武漢 430000

金針菇菇腳蛋白質(zhì)的提取

朱麗萍1，陸瑤1，胡國(guó)元1*，劉啟燕2

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.武漢如意食用菌生物高科技有限公司，湖北 武漢 430000

為了更好地利用金針菇加工副產(chǎn)物，采用單因素實(shí)驗(yàn)法探討了液料比、氫氧化鈉濃度、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果表明，對(duì)金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率影響較大的三個(gè)因子是液料比、提取溫度和提取時(shí)間.采用響應(yīng)面法對(duì)這三個(gè)因子的三個(gè)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示三因子對(duì)金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率的影響由大到小小依次為液料比、提取溫度、提取時(shí)間，其中對(duì)蛋白質(zhì)提取率有顯著影響的是提取溫度和液料比的交互作用，其他項(xiàng)的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率無(wú)顯著影響.優(yōu)化的堿法提取金針菇菇腳蛋白質(zhì)工藝條件是：液料比20∶1 mL／g、氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0．5 g每100 mL、提取溫度61℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)2次，金針菇菇腳蛋白質(zhì)堿法提取率最高值達(dá)到12.07%.

金針菇菇腳；蛋白質(zhì)；堿提；響應(yīng)面

0 引言

現(xiàn)今金針菇工廠化栽培規(guī)模逐漸擴(kuò)大，如何有效含有多種功能性蛋白的利用金針菇菇腳等副產(chǎn)物成為企業(yè)的關(guān)注重點(diǎn).堿溶酸沉法、酶解法、超聲波萃取法［1］、反膠束法［2］、鹽溶法［3］和膜分離法［4］是植物蛋白提取的主要方法.已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定堿法提金針菇菇腳蛋白質(zhì)的最佳條件［5］.但是利用響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇菇腳蛋白提取工藝的報(bào)道少見(jiàn)，在此背景下，本實(shí)驗(yàn)以金針菇工廠加工剩余的金針菇菇腳作原料，探討對(duì)金針菇菇腳蛋白提取率有較顯著影響的因素，再利用響應(yīng)曲面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)的提取參數(shù)，以期能充分利用金針菇的副產(chǎn)物，降低其對(duì)環(huán)境的危害的同時(shí)，提高農(nóng)戶(hù)和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 原料金針菇菇腳（菌柄基部1～3 cm）由武漢如意食用菌生物高科技有限公司提供.

1.1.2 試劑氫氧化鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、考馬斯亮藍(lán)G－250（分析純）、磷酸（分析純）、鹽酸（分析純），皆為市售.

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理將新鮮金針菇菇腳晾曬至半干后，放于烘箱中60℃鼓風(fēng)烘干，然后經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，d＜0．15 mm篩分，制得金針菇菇腳粉末，置于干燥器中保存?zhèn)溆?

1.2.2 菇腳蛋白質(zhì)的提取取制備好的金針菇菇腳粉末1 g置于錐形瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的NaOH溶液，于一定溫度下水浴浸提一段時(shí)間后，經(jīng)布氏漏斗加壓抽濾，收集濾液.將濾渣堿液重復(fù)提取1次，合并2次提取液即為菇腳蛋白質(zhì)提取液.

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別測(cè)定液料比（1∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g）、NaOH濃度（0．2、0．3、0．4、0．5、0．6 g/100 mL）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率的影響.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化法根據(jù)單因子試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)實(shí)驗(yàn)有較顯著影響的因素和水平，由Box－Behnken設(shè)計(jì)出分析因素與水平表（表1），再運(yùn)用Design Export 8．0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果.各因素的試驗(yàn)水平及編碼列于表1.其中A、B、C分別表示提取溫度（℃）、提取時(shí)間（min）及液料比（mL／g）.

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法［6］測(cè)定蛋白質(zhì)含量.

1.2.6 蛋白提取率的計(jì)算按照1．2．5中方法測(cè)定提取液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出稀釋1 000倍后提取液中蛋白的質(zhì)量.金針菇菇腳蛋白提取率計(jì)算公式如下：

表1 堿提法提取金針菇菇腳蛋白響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in RSM

2 結(jié)果和分析

2.1 菇腳蛋白的單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菇腳蛋白質(zhì)提取率受液料比的影響確定NaOH溶液質(zhì)量濃度＝0．5 g/100 mL，提取溫度為70℃，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，在此條件下測(cè)定不同液料比對(duì)金針菇菇腳蛋白質(zhì)的提取率.由圖1可以看出，當(dāng)液料比增加時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率呈增加趨勢(shì).

圖1 金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率受液料比的影響Fig.1 Effect of liquid－solid ratio on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.2 菇腳蛋白質(zhì)提取率受NaOH濃度的影響確定液料比為20∶1，提取溫度70℃，浸提時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，在此條件下，測(cè)定不同NaOH濃度下菇腳蛋白質(zhì)的提取率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaOH質(zhì)量濃度為0.5g/100mL之前，蛋白質(zhì)的提取率隨著NaOH濃度的增加而增加；NaOH質(zhì)量濃度0.5 g/ 100 mL之后，隨著NaOH濃度的增加，提取率反而有所下降（圖2）.

2.1.3 菇腳蛋白質(zhì)提取率受溫度的影響在液料比20∶1，NaOH質(zhì)量濃度為0．5 g／100 mL，浸提時(shí)間為2 h，提取次數(shù)2次條件下，測(cè)定不同提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)提取溫度增加時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì).在溫度為60℃之前，蛋白質(zhì)的提取率增加的幅度較大；溫度為60℃之后，提取率增加的幅度開(kāi)始降低（圖3）.

圖2 金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率受NaOH質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

圖3 金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率受溫度的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.4 菇腳蛋白質(zhì)提取率受時(shí)間的影響在液料比20∶1，每100 mL為NaOH質(zhì)量為0.5 g，提取溫度為70℃，提取次數(shù)2次條件下，測(cè)定不同提取時(shí)間下菇腳蛋白提取率的變化.結(jié)果顯示，提取時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)趨勢(shì)越緩慢（圖4）.

圖4 金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率受時(shí)間的影響Fig.4 Effect of time on extracting rate of F.velutipes’stipe protein

2.1.5 菇腳蛋白質(zhì)提取率受次數(shù)的影響在液料比20 mL／g，NaOH質(zhì)量濃度為每100 mL 0.5 g，提取溫度為70℃，浸提時(shí)間為2 h條件下，測(cè)定不同提取次數(shù)下菇腳蛋白提取率的變化.結(jié)果表明，當(dāng)提取次數(shù)增加，蛋白質(zhì)的提取率呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì)（圖5）.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率受次數(shù)的影響Fig.5 Effect of extracting times on extraction rate of F.velutipes’stipe protein

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果不顯著因素條件確定提取液NaOH質(zhì)量濃度、提取次數(shù)分別為，NaOH為0.5 g每100 mL、提取次數(shù)2次.選取有顯著影響的液料比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素為響應(yīng)面優(yōu)化法的因素水平，金針菇菇腳蛋白質(zhì)提取率為因變響應(yīng)值（y），響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果見(jiàn)下表2.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert 8．0軟件分析，建立金針菇菇腳蛋白提取率與提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）3個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.2 Experimental designs and results of Box-Behnken

Y=+2.160+0.400A+0.033B+0.440C+0.035AB-0.300AC-0.017BC-14.80A2-2.350B2-2.800C2

該方程中的系數(shù)表示各個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，由此方程可以預(yù)測(cè)得到各個(gè)不同條件組合下金針菇菇腳蛋白的提取率.

2.3 回歸模型的方差分析

對(duì)所得回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如下表3所示.

2.3.1 單因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響通過(guò)方差分析表，由F檢驗(yàn)，可以得出A－提取溫度、C－液料比對(duì)金針菇菇腳蛋白提取率的影響均為極顯著，而B(niǎo)－提取時(shí)間對(duì)金針菇菇腳蛋白提取率的影響不那么顯著.三個(gè)因素對(duì)提取質(zhì)量的影響的顯著性依次是：C＞A＞B，即液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間.

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

2.3.2 交互項(xiàng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響在響應(yīng)面的分析中，由等高線(xiàn)的圖形和顏色可以看出交互作用的顯著與否.圖形愈橢圓體現(xiàn)出交互作用愈強(qiáng)，愈趨向圓形就愈弱.再來(lái)分析圖的顏色，由藍(lán)變紅則提取率從小變大，變的愈快顯示坡度愈大，表示影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果更顯著，等高線(xiàn)代表的是在一條線(xiàn)上所有的組合方案得到的蛋白質(zhì)提取率都一樣.

圖6～8表明，提取溫度（A）和液料比（C）之間的交互作用顯著（p＜0．05），表現(xiàn)為等高線(xiàn)呈橢圓形，顏色變化更為分明.提取溫度（A）和提取時(shí)間（B）、提取時(shí)間（B）和液料比（C）相對(duì)而言交互作用不顯著.

圖7是在提取時(shí)間為2 h時(shí)，提取溫度（A）和液料比（C）交互作用對(duì)菇腳蛋白提取率影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖.由圖可知，隨提取溫度的增加，菇腳蛋白質(zhì)的提取率變化為先增加后降低.當(dāng)液料比較低時(shí)，得率變化很小，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面平滑，說(shuō)明提取溫度對(duì)菇腳蛋白提取率影響不顯著；而當(dāng)液料比逐漸增加這種變化趨勢(shì)較為明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面變陡，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)菇腳蛋白提取率影響顯著.在液料比為20∶1時(shí)提取率達(dá)到最高；當(dāng)液料比進(jìn)一步增加，這種變化趨勢(shì)開(kāi)始減緩，響應(yīng)曲面表現(xiàn)為平滑.當(dāng)提取溫度漸漸上升，液料比對(duì)提取率的影響呈現(xiàn)相似的效應(yīng).等高圖的中心位置即提取溫度60℃、液料比20∶1是提取率的較高點(diǎn).

圖6 對(duì)蛋白提取率受時(shí)間和溫度交互作用的影響Fig.6 The impact of temperature and time on extraction rate of protein

圖7 蛋白提取率受溫度和液料比交互作用的影響Fig.7 The impact of temperature and liquid－solid ratio on extraction rate of protein

圖8 蛋白提取率受時(shí)間和液料比交互作用的影響Fig.8 The impact of time and liquid－solid ratio on extraction rate of protein

2.3.3 響應(yīng)面模型評(píng)估從表4可信度分析結(jié)果可知，R2（Pred R－Square）達(dá)到0.936 7，表明新觀測(cè)值的好壞可以較好地被此模型所預(yù)測(cè).

R2（R－Square）達(dá)到0．995 6，表明實(shí)驗(yàn)所試驗(yàn)點(diǎn)的適配度為99．56%，模型擬合度很高，實(shí)驗(yàn)誤差較小.

修正R2（Adj R－Square）為0．987 7，表明98．77%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性可以被解釋.

同時(shí)R2（R－Square）與修正R2（Adj R－Square）兩值接近，更說(shuō)明建立的模型擬合性好、可靠.

Adeq Precision＞4表明該模型具有足夠分辨力，這個(gè)模型可以用于實(shí)踐.

以上幾個(gè)重要的評(píng)估模型好壞的參數(shù)均說(shuō)明本模型擬合較好，適合對(duì)金針菇菇腳蛋白提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).

表4 回歸模型的評(píng)估Table 4 The assessment of the regression model

2.3.4 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)回歸方程：

可以得到提取的最優(yōu)條件.由回歸方程可得：

將式（1）、（2）、（3）聯(lián)立方程組，解得A＝0．130，B＝0．008，C＝0．068，將編碼值轉(zhuǎn)換成實(shí)際條件得到提取溫度＝61．30℃，提取時(shí)間＝2．01 h，液料比為20．34 mL／g.將上述優(yōu)化的提取條件進(jìn)行菇腳蛋白質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證響應(yīng)面模型所得數(shù)據(jù)的可靠性.但為實(shí)際操作方便，將提取金針菇菇腳蛋白的最佳工藝條件修正為：提取溫度61℃，提取時(shí)間2h，液料比20 mL／g.在此條件下蛋白質(zhì)實(shí)測(cè)提取率為12．07%，而由回歸模型所預(yù)測(cè)的理論提取率為12．20%，理論預(yù)測(cè)值比實(shí)際測(cè)定值高1．07%.顯示各個(gè)因素同菇腳蛋白質(zhì)提取率之間的關(guān)系可以很好的被該模型所預(yù)測(cè).以上可以說(shuō)明，由響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化得到了確信可靠的菇腳提取參數(shù)，且得到了適配性良好的回歸模型.

3 結(jié)語(yǔ)

本研究的目的是對(duì)金針菇菇腳蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)液料比、NaOH濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提次數(shù)進(jìn)行分析，得到單因素實(shí)驗(yàn)下菇腳蛋白提取率的變化趨勢(shì)圖.在此結(jié)果上選擇有顯著影響的三個(gè)因素提取溫度、提取時(shí)間和液料比，運(yùn)用響應(yīng)面分析法進(jìn)行進(jìn)一步研究.

通過(guò)以提取溫度（50～70℃）、提取時(shí)間（1～3 h）、液料比（15～25 mL／g）作為提取的因素和水平，用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn).通過(guò)借助Design Export 8．0的分析我們可以得到以下結(jié)論：

a．各個(gè)因素對(duì)菇腳蛋白提取率的影響為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間.

b.提取溫度和液料比的交互作用對(duì)菇腳蛋白質(zhì)提取率有顯著影響，其他任意兩項(xiàng)的交互作用對(duì)菇腳蛋白質(zhì)提取率無(wú)明顯影響.

c.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的提取菇腳蛋白的提取工藝條件是：液料比20∶1 mL/g、NaOH質(zhì)量濃度為0．5 g/ 100 mL、提取溫度61℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)為2次，理論上最佳提取率為12．20%.在此條件下菇腳蛋白的實(shí)測(cè)提取率為12．07%，誤差在可接受范圍內(nèi).說(shuō)明本模型擬合很好，為分析和預(yù)測(cè)金針菇菇腳蛋白質(zhì)的提取工藝提供了理論依據(jù).

致謝

感謝武漢工程大學(xué)研究生處對(duì)本研究提供的資助！

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Extraction technology of protein from base of Flammulina velutipes

ZHU Li－ping1，LU Yao1，HU Guo－yuan1，LIU Qi－yan2
1.School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Wuhan Wishful Edible Fungi Bio－Tech Co．，Ltd．，Wuhan 430000，China

To use the processing byproducts ofFlammulina velutipesbetter，the effects of the ratio of water to material，the extraction temperature，the extraction time，the extraction times on the extraction ratio of protein from the base of F．velutipes’stipe were studied by single factor experiment．The result shows that the ratio of water to material，the extraction temperature and the extraction time have impacts on the extraction ratio of protein．Then three levels of the three factors were analyzed by response surface method．The result show that the size order of factors’influence on the extraction ratio of the protein from the base ofF．velutipes’stipe is：the ratio of water to material＞the extraction temperature＞the extraction time，in which the interaction of the extraction temperature and the ratio of water to material has a significant effect on the extraction ratio of the protein and the interaction of the other factors has little impact．The optimal conditions of extracting protein from the base ofF．velutipes’stipe are the ratio of water to material of 20∶1 mL／g，the sodium hydrate concentration of 0．5 g／100 mL，the extraction temperature of 61℃，the extraction time of 2 h，and the extraction times of 2 times；the extraction ratio of the protein reaches 12．07%under the condition．

the base ofFlammulina velutipes’stipe；protein；NaOH extraction；the response surface

TQ936.1

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.05.005

1674－2869（2015）06－0021－06

本文編輯：張瑞

2015－04－09

武漢工程大學(xué)第六屆研究生教育創(chuàng)新基金（CX2014016）

朱麗萍（1990－），女，湖北荊州人，碩士研究生.研究方向：微生物發(fā)酵.*通信聯(lián)系人