曹 奕 吳洪喜 陳愛華① 吳楊平 張 雨王 超 張志偉 姚國(guó)興 蔡永祥

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所 江蘇省海洋經(jīng)濟(jì)貝類研究開發(fā)中心 南通 226007;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州 325005)

大竹蟶(Solen grandis)隸屬瓣鰓綱、竹蟶科、竹蟶屬,在渤海遼東灣與萊州灣、南海北部灣、黃海朝鮮灣、海州灣及南部海域均有分布。其個(gè)體較大,肉質(zhì)鮮美,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類。近年來,因大竹蟶市場(chǎng)需求擴(kuò)大導(dǎo)致的過度采捕,以及海洋生態(tài)環(huán)境的惡化,造成了大竹蟶野生資源量的急劇減少,故需通過人工增養(yǎng)殖等手段來對(duì)大竹蟶資源進(jìn)行保護(hù)。近十幾年以來,江蘇、山東等地均開展了對(duì)于大竹蟶人工繁育技術(shù)的研究(侯和要等,2004;陳愛華等,2009),并進(jìn)行了規(guī)模不等的增殖放流活動(dòng);其中,江蘇省海洋水產(chǎn)研究所以江蘇啟東大竹蟶群體為親本育成幼苗放流至江蘇蔣家沙海域的規(guī)模為最大,自 2007年來,共計(jì)放流4.5mm左右的苗種6.26×108ind,江蘇大竹蟶資源量上升明顯。然而,人工繁育群體的瓶頸效應(yīng)和近交衰退現(xiàn)象較野生群體更為明顯,在一定程度上會(huì)導(dǎo)致群體遺傳多樣性的改變。而遺傳多樣性水平與生長(zhǎng)速度、抗病能力等生產(chǎn)性狀密切相關(guān)(李俊清等,2006)。因此,對(duì)大竹蟶野生群體和增殖放流群體遺傳多樣性水平進(jìn)行鑒定,一方面能夠確保我國(guó)種質(zhì)資源的可持續(xù)利用,另一方面能為后續(xù)的良種選育研究提供理論數(shù)據(jù)。

ISSR作為一種共顯性、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉的分子標(biāo)記,已被廣泛運(yùn)用在貝類遺傳學(xué)研究中。目前國(guó)內(nèi)對(duì)大竹蟶群體的研究主要采用SSR和AFLP等方法(喬洪金等,2012;張?zhí)系?2013),本文通過該技術(shù)對(duì)我國(guó)沿海大竹蟶群體進(jìn)行遺傳多樣性研究,評(píng)判增殖放流活動(dòng)對(duì)野生群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響,能夠了解大竹蟶當(dāng)前的種質(zhì)資源狀況,為合理保護(hù)該資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年11月至2014年3月,通過實(shí)地采樣獲得廣西北海、江蘇啟東、山東日照、遼寧營(yíng)口、河北秦皇島、江蘇蔣家沙增殖放流區(qū)等處大竹蟶(采樣信息見表1)。每個(gè)群體選取25個(gè)規(guī)格較為一致的健康個(gè)體,取其斧足,用于實(shí)驗(yàn)。

表1 大竹蟶樣品采集時(shí)間及經(jīng)緯度Tab.1 Sampling time,longitudes and latitudes of the S.grandis population

1.2 DNA提取

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法進(jìn)行提取。紫外分光光度計(jì)OD-1000測(cè)定樣品DNA的濃度和純度,并進(jìn)行電泳驗(yàn)證,提取所得的DNA保存在–20°C環(huán)境下。

1.3 引物合成及篩選

由上海生工生物工程有限公司合成60條ISSR引物用于篩選,其序列均來自哥倫比亞大學(xué)(UBC)。PCR 反應(yīng)體系含 50ng/μL 模板 DNA 1.0μL,10×PCR buffer (含 Mg2+)2.5μL,10mmol/L dNTP 1.0μL,10μmol/L引物 1μL,5U/μL Taq 酶 0.2μL,加 ddH2O 至 25μL;反應(yīng)條件如下: 反應(yīng)前94°C預(yù)變性4min,94°C變性45s,38—55°C 退火 45s,72°C 延伸 60s,共 35個(gè)循環(huán),反應(yīng)后72°C延伸7min。

1.4 ISSR-PCR

篩選得出10條結(jié)果較佳的引物對(duì)大竹蟶6個(gè)群體共 150個(gè)樣品進(jìn)行 ISSR-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳(120V,100mA,90min),EB染色后用Bio-Rad Doc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照。對(duì)所得電泳圖進(jìn)行分析。電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 UBC 824引物對(duì)BH群體的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of ISSR-PCR of primer UBC 824 to BH population

1.5 數(shù)據(jù)分析

獲得ISSR電泳圖譜后,用Quantity One軟件進(jìn)行分析,將所得結(jié)果進(jìn)行歸類。采用Popgene32軟件進(jìn)行遺傳參數(shù)分析,并根據(jù)各群體遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算了群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體總基因多樣性(Ht)、各群體間的遺傳分化指數(shù)(Gst)(Gst=1–Hs/Ht)(Slatkin et al,1989)、遺傳距離(D)(Nei,1978)?；谶z傳距離,用Mega5.0軟件構(gòu)建6個(gè)群體及150個(gè)樣品的 UPGMA聚類樹。利用 Arlequin 3.5軟件(Excoffier et al,2010)對(duì)所有群體間和群體內(nèi)的遺傳變異進(jìn)行分子變異分析(AMOVA),計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)(Φst)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大竹蟶群體內(nèi)的遺傳分析

篩選得出的10條引物序列見表2,從所有6個(gè)群體中共擴(kuò)增得到清晰位點(diǎn) 127個(gè),其中多態(tài)性位點(diǎn)118個(gè)(PPB=92.91%)。5個(gè)野生群體的H值和I值分別在0.0982—0.1633和0.1603—0.2776之間(見表3),江蘇蔣家沙增殖放流各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均低于親本QD野生群體。

2.2 大竹蟶群體間的遺傳分化

野生群體間 Gst=0.1065,增殖放流群體(JJ)與其親本 QD群體的Gst=0.0235,所有群體的遺傳分化系數(shù) Gst=0.1370(見表 4)。野生群體兩兩間 Gst在0.0525—0.0857間,其中 BH群體與其余野生群體間Gst均在0.07以上(見表6)。

表2 篩選獲得引物序列Tab.2 The nucleotide sequences of selected primer

而從AMOVA分析結(jié)果可以看出,Φst=0.1268,即在總變異中,12.68%的變異歸因于大竹蟶群體間的變異,87.32%的變異歸因于群體內(nèi)的變異,群體間和群體內(nèi)變異均顯著(P＜0.01)(見表5),該結(jié)果與分析所得的Gst值基本一致。

2.3 遺傳距離與聚類分析

利用 Popgene32軟件計(jì)算了大竹蟶各群體間的Nei’s遺傳距離(見表6)。5個(gè)大竹蟶野生群體間遺傳距離值變化范圍為 0.0139—0.0387,而增殖放流群體(JJ)與其親本QD群體的遺傳距離僅為0.0088。

表3 大竹蟶6個(gè)群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity of the six S.grandis populations

表4 不同群體間的遺傳分化分析Tab.4 Analysis of genetic differentiation among populations

表5 大竹蟶群體間和群體內(nèi)分子變異的AMOVA分析結(jié)果Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA)within/among S.grandis populations

表6 大竹蟶6個(gè)群體間遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Tab.6 Genetic distance and genetic diversity coefficient of the six S.grandis populations

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算所得的遺傳距離,通過Mega5.0軟件構(gòu)建了UPGMA聚類樹。6個(gè)大竹蟶群體的聚類結(jié)果見圖2。QD群體與JJ群體首先聚為一支,接著與RZ群體聚為一支,QH群體與YK群體聚為另一支,最后與 BH群體聚在一起。150個(gè)個(gè)體的聚類結(jié)果見圖3。由圖3可見,6個(gè)群體中大部分個(gè)體各自獨(dú)立匯聚成一支。只有少數(shù)個(gè)體出現(xiàn)在其它支系中,該情況QD、JJ群體中各有3個(gè),YK、QH群體各有1個(gè)。從不同群體角度來看,個(gè)體間的聚類結(jié)果與群體間的聚類結(jié)果相一致。

圖2 大竹蟶野生群體和增殖放流群體的UPGMA聚類圖Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree of stock and wild S.grandis populations

圖3 大竹蟶150個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類圖Fig.3 The UPGMA dendrogram of 150 individuals from the six population of S.grandis

3 討論

3.1 大竹蟶群體間的遺傳多樣性分析

表3顯示,BH群體的PPB、H、I值分別為0.1633、0.2776,和69.45%,為5個(gè)野生群體的最高值,QH群體的相應(yīng)指標(biāo)則為 0.0982、0.1603和 58.23%,為 5個(gè)野生群體的最低值。QH群體遺傳多樣性水平的低下可能與所處海域有關(guān)。秦皇島位于環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)圈中心地帶,陸域污染源較多,同時(shí)自身水動(dòng)力條件較差決定了該海域自凈能力有限,造成該區(qū)域種群長(zhǎng)期遭受環(huán)境污染,從而使得種群數(shù)量減少或敏感性個(gè)體缺失,群體遺傳多樣性水平下降,大大降低了生物資源的利用率(Krane et al,1999)。

本研究還特別關(guān)注了江蘇蔣家沙增殖放流群體,研究分析了增殖放流對(duì)群體的遺傳結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明蔣家沙增殖放流群體 Nei's基因多樣性、Shannon's信息指數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為0.1054、0.1850、60.17%,而其親本群體即啟東野生群體相應(yīng)數(shù)值則為0.1507、0.2655、66.02%。兩者相比而言,增殖放流群體的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均有所下降。推測(cè)該結(jié)果與下列因素有關(guān): 增殖放流群體親本的選擇區(qū)域狹窄,僅為啟東呂四港附近約 100公頃的海域;且有效親本使用量較低,每年使用親本量大約為50kg。以上情況均可導(dǎo)致培育的苗種在人工繁殖過程中出現(xiàn)近交現(xiàn)象。為避免增殖放流群體的遺傳多樣性下降,可采取的措施有: 一是擴(kuò)大親本選擇區(qū)域,二是提高親本的數(shù)量和品質(zhì)。

3.2 分子標(biāo)記的選擇及大竹蟶與其它貝類群體遺傳多樣性的比較分析

通過對(duì)幾種基于 PCR技術(shù)的分子標(biāo)記進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),與SSR標(biāo)記相比,ISSR引物開發(fā)費(fèi)用低,可以在不同物種間通用。與RAPD單引物相比,ISSR揭示的多態(tài)性百分率較高,而且其具有較高的退火溫度,重復(fù)性好,穩(wěn)定性高。相對(duì)于AFLP而言,ISSR費(fèi)用較低,反應(yīng)體系具有一定的通用性,操作簡(jiǎn)單,可廣泛應(yīng)用。綜合考慮,本研究運(yùn)用 ISSR標(biāo)記進(jìn)行研究相對(duì)較好。

表 7列舉了相關(guān)海洋經(jīng)濟(jì)貝類分子標(biāo)記的分析結(jié)果,將6個(gè)群體大竹蟶的多態(tài)位點(diǎn)百分率、Nei's 基因多樣性指數(shù)與其比較,發(fā)現(xiàn)參數(shù)相近,說明在群體水平上大竹蟶具有較高的遺傳多樣性。

廣布種貝類如縊蟶(S.constricta)、四角蛤蜊(M.veneriformis)、青蛤(Cyclina sinensis),和西施舌(Mactra antiquata)群體間遺傳差異相對(duì)較大(Nei's多樣性指數(shù)普遍相差 0.04以上)(表 7),而翡翠貽貝(Penera viridis)和馬氏珠母貝(Pinctada martensi)等僅分布于東南沿海的貝類,其各個(gè)群體間遺傳多樣性差異相差甚微(馬氏珠母貝各群體Nei's多樣性指數(shù)僅相差0.0003)。由此可見,廣布種比狹域分布的物種具有更多的遺傳差異。本研究結(jié)果表明大竹蟶群體間遺傳多樣性水平差異較大(0.0651),符合其作為廣布種的實(shí)際情況,為物種水平上的遺傳變異提供了理論基礎(chǔ)。

表7 大竹蟶與其它貝類的遺傳多樣性比較Tab.7 Comparison in genetic diversity between S.grandis and other clams

3.3 大竹蟶群體的遺傳分化狀況

分化系數(shù)在 0—0.05之間,群體間分化很弱,0.05—0.15之間表示中等分化,0.15—0.25之間表示分化大,大于 0.25表示分化極大(Wright,1978)。JJ群體與其親本QD群體的Gst＜0.05,表明增殖放流群體與其野生親本群體并沒有產(chǎn)生明顯的遺傳分化。而各野生群體間 Gst在 0.0525—0.0857間,均達(dá)到中等分化水平。所有群體間也達(dá)到了中等分化水平(0.1370)。該研究結(jié)果表明江蘇啟東大竹蟶種質(zhì)狀況較好,數(shù)年來的人工育苗、增殖放流沒有使得啟東群體產(chǎn)生明顯的遺傳變異,依然可以通過增殖放流手段實(shí)現(xiàn)對(duì)大竹蟶資源的保護(hù)。

AMOVA分析結(jié)果表明大竹蟶群體間和群體內(nèi)分化均達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。Φst=0.1268,即在總變異中,87.32%的變異來自群體內(nèi),該結(jié)果與分析所得的Gst值基本一致。

3.4 大竹蟶群體間的親緣關(guān)系分析

遺傳距離是衡量群體間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)。Thorp研究認(rèn)為,遺傳距離D＞0.15的兩個(gè)群體,不可能是同一物種;同科屬間 D=0.5—0.9;不同物種間D=0.2—0.8;同種不同群體D=0.03—0.2 (Thorp,1982)。6個(gè)大竹蟶群體的遺傳距離大致在0.01—0.04范圍之內(nèi),屬于同種不同群體。聚類關(guān)系也反映了群體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。本研究的聚類結(jié)果顯示,南通的兩個(gè)群體(QD,JJ)首先聚為一支,接著與同為南黃海區(qū)域的 RZ群體聚為一支,同為 渤海區(qū)域的 QH群體與YK群體則聚為另一支,最后與南海區(qū)域的 BH群體聚在一起。由此推斷沿海大竹蟶群體間親緣關(guān)系和地理距離存在相關(guān)性。而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是大竹蟶的浮游幼蟲期只有 6—8d (陳愛華等,2009),自然水流的作用只能在較近范圍內(nèi)形成基因交流。這一原因同樣能夠解釋個(gè)體的聚類結(jié)果中少數(shù)個(gè)體出現(xiàn)在鄰近地理群體支系中的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本研究分析了我國(guó)沿海大竹蟶的遺傳多樣性狀況,并對(duì)人工增殖放流活動(dòng)對(duì)野生群體的影響情況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,我國(guó)沿海大竹蟶在保持著高遺傳多樣性水平的同時(shí),不同野生地理群體之間已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的分化。開展的增殖放流活動(dòng)會(huì)使得本地野生群體的遺傳多樣性有所下降,但不會(huì)產(chǎn)生明顯的遺傳變異?？梢缘贸鼋Y(jié)論: 人工增殖放流仍然能夠作為主要的大竹蟶野生資源恢復(fù)手段,但在苗種培育過程中,應(yīng)當(dāng)在保證親本數(shù)量及品質(zhì)的情況下盡量擴(kuò)大選擇范圍;同時(shí),注意對(duì)本地原種加大保護(hù)力度,避免異地繁養(yǎng)帶來的遺傳變異。相關(guān)監(jiān)測(cè)工作仍需持續(xù)進(jìn)行,以便對(duì)我國(guó)沿海大竹蟶資源的保護(hù)狀況進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估。

么宗利,周 凱,來琦芳等,2005.我國(guó)五個(gè)青蛤地理群體遺傳變異的RAPD分析.海洋漁業(yè),27(2): 102—107

牛東紅,李家樂,馮冰冰等,2009.縊蟶 6個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),15(3): 332—336

呂林蘭,杜曉東,王 嫣等,2008.馬氏珠母貝 3個(gè)野生種群及種群間雜交后代遺傳多樣性的ISSR分析.水生生物學(xué)報(bào),32(1): 26—32

喬洪金,劉相全,孫國(guó)華等,2012.大竹蟶(Solen grandis)cDNA文庫(kù)中微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選.海洋與湖沼,43(6):1128—1133

杜曉東,李 康,黃榮蓮等,2007.翡翠貽貝 3個(gè)野生種群遺傳多樣性分析.熱帶海洋學(xué)報(bào),26(4): 51—55

李俊清,李景文,2006.保護(hù)生物學(xué).北京: 中國(guó)林業(yè)出版社

張 滔,劉相全,孫國(guó)華等,2013.大竹蟶(Solen grandis)不同地理群體遺傳多樣性的 AFLP 分析.海洋與湖沼,44(2):525—530

陳愛華,姚國(guó)興,張志偉,2009.大竹蟶生產(chǎn)性人工繁育試驗(yàn).海洋漁業(yè),31(1): 66—72

孟學(xué)平,王 帥,高如承等,2011.西施舌群體遺傳結(jié)構(gòu)及分化的RAPD分析.海洋科學(xué),35(2): 6—10

侯和要,牟乃海,宋全山等,2004.大竹蟶人工繁殖技術(shù)研究.齊魯漁業(yè),21(6): 32—35

Excoffier L,Lischer H E L,2010.Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows.Molecular Ecology Resources,10(3): 564—567

Hou L,Lü H L,Zou X Y et al,2006.Genetic characterizations of Mactra veneriformis (Bivalve)along the Chinese coast using ISSR-PCR markers.Aquaculture,261(3): 865—871

Krane D E,Sternberg D C,Burton G A,1999.Randomly amplified polymorphic DNA profile-based measures of genetic diversity in crayfish correlated with environmental impacts.Environmental Toxicology and Chemistry,18(3):504—508

Nei M,1978.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals.Genetics,89(3):583—590

Slatkin M,Barton N H,1989.A comparison of three indirect methods for estimating average levels of gene flow.Evolution,43(7): 1349—1368

Thorp J P,1982.The molecular clock hypothesis: biochemical evolution,genetic differentiation and systematics.Annual Review of Ecology and Systematics,13(1): 139—168

Wright S,1978.Evolution and the genetics of populations 4.Variability within and among natural populations.Chicago:University of Chicago Press,4