馬細蘭 張 勇 陳勇智 周立斌

(1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系 生物技術(shù)研究所 惠州 516007;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 水生經(jīng)濟動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟動物良種繁育重點實驗室 廣州 510275)

脊椎動物的繁殖和生長活動不但密切聯(lián)系而且相互作用,生長激素受體(Growth hormone receptor,GHR)基因的mRNA表達在動物性腺中可普遍檢測到,雌激素應(yīng)答元件在哺乳動物GHR基因的5’調(diào)控區(qū)也有發(fā)現(xiàn)(Goodyer et al,2001)。性類固醇激素調(diào)節(jié)脊椎動物生長軸相關(guān)基因的表達存在一定物種的差異性。用雌二醇(17β-estradiol,E2)處理可降低兔肝臟 GHR mRNA 水平(Domené et al,1994),但提高大鼠肝臟GHR mRNA水平(Gabrielsson et al,1995)。雄激素對GHR的表達同樣有影響,向垂體切除大鼠注射睪酮(Testosterone,T)可誘導(dǎo)其肝臟GHR mRNA水平上升(Zung et al,1999),說明T會促進生長激素GH介導(dǎo)的生理作用。雄激素和雌激素在調(diào)節(jié)動物的生長時可能起不同的作用,雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)促進生長,與此相反,E2抑制生長(Borski et al,1996)。

許多動物的雌雄個體存在較大差異,雌雄生長速度也存在差異,并且這種差異在動物性腺發(fā)育成熟時更為明顯,這可能與性類固醇激素的不同分泌水平有關(guān)(Mandiki et al,2004,2005)。哺乳動物生長的性別二態(tài)性通過血液循環(huán)中的性類固醇激素、GH和IGF-I的相互作用來調(diào)節(jié)(Wehrenberg et al,1992)。許多魚類有明顯的生長性別二態(tài)性,尼羅羅非魚是其中一種。尼羅羅非魚雄魚比雌魚的生長明顯要快,而且這種生長差異在性腺成熟時更加顯著。

性類固醇激素對動物的生長有一定的影響,但其對魚類雌雄生長差異的影響機理尚不清楚。為了進一步了解動物雌雄生長差異的內(nèi)在原因,作者通過在體注射實驗,比較了兩種性類固醇激素(E2、MT)對雌、雄尼羅羅非魚生長及生長軸相關(guān)基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

尼羅羅非魚采自廣東省番禺國家級羅非魚良種場,參照文獻(馬細蘭等,2010),設(shè)計了長期注射和短期注射兩個實驗。實驗室自配魚用生理鹽水(PS);雌二醇(17β-estradiol,E2)和甲基睪酮(17α-methyltestosterone,MT)均為美國Sigma公司產(chǎn)品(Sigma,America),溶于花生油后注射,濃度均為50μg/g體重。對于長期注射實驗,分別在注射后第 0、2、6、10周采樣,測體長、體重、肝重等,檢測性類固醇激素對尼羅羅非魚生長性能的影響;對于短期注射實驗,則在注射后第 6、12、24h采樣,采用Real-time PCR檢測性類固醇激素E2、MT對生長軸基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)mRNA表達的影響。實驗試劑及儀器設(shè)備參照文獻(馬細蘭等,2010)。

1.2 方法

1.2.1 生長性能分析 選用以下幾種參數(shù),計算公式如下:

1.2.2 生長軸相關(guān)基因表達分析 采用 Real-time PCR檢測性類固醇激素(E2、MT)對垂體 GH、肝臟GHR、肝臟IGF-I mRNA表達的影響,各基因特異性引物參見表1。Real-time PCR方法參照文獻(馬細蘭等,2010),略有修改。

2 結(jié)果

2.1 長期注射E2、MT對生長的影響

雄魚在整個實驗過程中的體重均大于雌魚。從注射后42天起,E2明顯促進雌魚的生長(P＜0.05),但不影響雄魚的生長(P＞0.05);MT明顯增加雄魚體重(P＜0.05),但對雌魚體重無顯著影響(P＞0.05)(圖1)。

表1 熒光實時定量PCR分析所用引物Tab.1 Primers for real-time PCR

圖1 性類固醇激素對尼羅羅非魚體重的影響(a.雌魚,b.雄魚)Fig.1 Effects of steroid hormones on body weights of female(a)and male (b)Nile tilapia

性類固醇激素E2、MT既影響了尼羅羅非魚體重,同時還影響了尼羅羅非魚其它各項生長參數(shù)。由表2可以看出,性類固醇激素E2、MT對尼羅羅非魚生長的影響存在明顯的性別二態(tài)性。不同組魚的肥滿度(K)沒有顯著差異(P＞0.05),性類固醇激素不影響尼羅羅非魚的K(P＞0.05);所有組中雌魚的性成熟度(GSI)都顯著高于雄魚(P＜0.05),但性類固醇激素對 GSI無顯著影響(P＞0.05);MT組雄魚的肝體系數(shù)(HSI)顯著高于其它組(P＜0.05),MT顯著提高雄魚的HSI而不影響雌魚的HSI,E2明顯提高雌魚的HSI(P＜0.05),但對雄魚的HSI無影響(P＞0.05);E2顯著提高雌魚的絕對生長率(AGRW),提高了 24.16%,但不影響雄魚的AGRW,MT顯著提高雄魚和雌魚的 AGRW分別提高了 14.09%和 11.20%(表 2)。

表2 生長參數(shù)(平均值±標準誤,n=20)Tab.2 Growth parameters (mean values±S.D.,n=20)

2.2 長期注射E2、MT對生長軸相關(guān)基因表達的影響

2.2.1 垂體 GH mRNA 長期注射 E2可使雌魚垂體GH mRNA水平明顯升高(P＜0.05),但對雄魚垂體GH mRNA 的表達無顯著影響(P＞0.05);長期注射MT可顯著提高雄魚垂體 GH mRNA水平(P＜0.05),但不影響雌魚垂體GH mRNA的表達(圖2)。

圖2 性類固醇激素對尼羅羅非魚垂體GH mRNA水平的影響Fig.2 Real-time PCR analysis on pituitary GH mRNA levels in Nile tilapia

2.2.2 肝臟 GHR1 mRNA 長期注射E2可促進雌魚(P＜0.05),但不影響雄魚肝臟GHR1 mRNA的表達;長期注射MT,雄魚肝臟GHR1 mRNA的表達有顯著提高(P＜0.05),對雌魚無影響(圖3)。

圖3 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟GHR1 mRNA水平的影響Fig.3 Real-time PCR analysis on liver GHR mRNA levels in Nile tilapia

2.2.3 肝臟 IGF-I mRNA 長期注射 E2同時提高雌魚和雄魚肝臟IGF-I mRNA表達水平(P＜0.05);長期注射MT,雄魚肝臟IGF-I的mRNA表達顯著提高(P＜0.05),但對雌魚無明顯影響。E2對雌魚肝臟IGF-I表達的促進作用低于 MT對雄魚的促進作用(P＜0.05)(圖4)。

2.3 短期注射E2、MT對生長軸相關(guān)基因表達的影響

2.3.1 垂體 GH mRNA 短期注射性類固醇激素E2、MT,對尼羅羅非魚垂體GH mRNA表達的作用顯示出明顯的性別二態(tài)性。注射E26h后,可快速、明顯提高雌魚垂體GH mRNA的表達,但顯著降低雄魚的表達(P＜0.05);相反,注射MT 12h后,可明顯提高雄魚垂體GH mRNA的表達,但顯著降低雌魚的表達(P＜0.05)(圖5)。

圖4 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA水平的影響Fig.4 Real-time PCR analysis on liver IGF-I mRNA levels in Nile tilapia

2.3.2 肝臟 GHR1 mRNA 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟 GHR1 mRNA表達的調(diào)節(jié)也存在性別二態(tài)性。E2作用12h后明顯促進雌魚肝臟GHR1 mRNA的表達(P＜0.05),24h后小幅度下調(diào)雄魚的表達(P＜0.05);MT作用 12h后可明顯提高雄魚肝 GHR1 mRNA的表達(P＜0.05),24h后可進一步提高雄魚肝臟 GHR1的表達,24h后還可小幅度上調(diào)雌魚肝臟GHR1 的表達(P＜0.05)(圖6)。

2.3.3 肝臟 IGF-I mRNA 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA表達的調(diào)節(jié)同樣存在雌雄差異性。注射E224h后,雌魚肝臟IGF-I mRNA的表達明顯升高,但雄魚的表達受到抑制(P＜0.05);MT作用 24h后顯著提高雄魚肝臟 IGF-I mRNA的表達(P＜0.05),而對雌魚肝臟IGF-I的mRNA表達則無顯著影響(圖7)。

3 討論

對性類固醇激素調(diào)節(jié)哺乳動物生長的研究較多,對魚類的研究較少。本文報道了性類固醇激素 E2、MT調(diào)節(jié)尼羅羅非魚生長的性別二態(tài)性,即 E2、MT對尼羅羅非魚雌、雄魚的生長均有調(diào)節(jié)作用,并且這種調(diào)節(jié)作用存在明顯的雌雄差異性。雄激素MT不但促進雄魚還促進雌魚的生長,并提高生長軸相關(guān)基因(垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I)的mRNA表達水平;雌激素E2則僅促進雌魚的生長和提高雌魚垂體GH、肝臟GHR1、IGF-I的表達水平,對雄魚的生長和生長軸相關(guān)基因的表達卻有下調(diào)趨勢。

圖5 性類固醇激素對尼羅羅非魚垂體GH mRNA水平的影響Fig.5 Real-time PCR analysis on pituitary GH mRNA levels in Nile tilapia

尼羅羅非魚雌魚的性成熟度(GSI)顯著高于雄魚,提示雌魚分配了更多的能量在生殖上,從而減少了在生長上的能量分配,這也是雌魚生長比雄魚慢的一個原因。

一方面,性類固醇激素可能通過影響魚類的攝食、消化來影響生長,另一方面,也可能通過影響生長軸的激素水平、受體濃度、結(jié)合蛋白水平等來調(diào)節(jié)生長(Mandiki et al,2004,2005;Meinhardt et al,2006)。 對哺乳動物、鳥類、魚類中雄性個體較雌性個體大的物種進行研究,結(jié)果表明雄激素同時也是一種代謝激素,可以促進動物的肌肉和骨骼生長。但十分有趣的是,雄激素不但不促進反而會抑制某些雌性個體較大的爬行類動物的生長(Cox et al,2005)。甲基睪酮(MT)可顯著增加尼羅羅非魚的攝食,并提其高生長速率,血清中 T的濃度雄魚高于雌魚,從而使雄魚的生長速度顯著高于雌魚(Riley et al,2002)。在本研究中,甲基睪酮(MT)明顯促進尼羅羅非魚雄魚的生長,原因可能包括以下幾點: (1)MT可能增加了雄魚的攝食,從而促進其生長;(2)MT可能提高了雄魚肝臟GHR對GH的敏感性;(3)MT對雄魚生長軸相關(guān)基因的mRNA表達均有促進作用,使雄魚血清中的GH或IGF-I水平提高,從而加快雄魚的生長。

圖6 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟GHR1 mRNA水平的影響Fig.6 Real-time PCR analysis on liver GHR mRNA levels in Nile tilapia

雄激素對哺乳動物生長激素受體GHR的影響表現(xiàn)出種間特異性。給兔注射睪酮T,可提高肝臟GHR mRNA的水平(Yu et al,1996),但不影響大鼠肝臟GHR mRNA水平(Gabrielsson et al,1995)。迄今,有關(guān)雄激素對硬骨魚類GHR調(diào)節(jié)的研究報道不多。南方鲇在體注射MT后,肝臟GHR mRNA水平的顯著升高(章力等,2006)。在本文中,給尼羅羅非魚長期注射MT,可顯著提高雄魚肝臟GHR mRNA的水平,但對雌魚沒有顯著影響,MT對尼羅羅非魚肝臟 GHR mRNA的調(diào)節(jié)作用存在明顯的性別差異性。

圖7 性類固醇激素對尼羅羅非魚肝臟IGF-I mRNA水平的影響Fig.7 Real-time PCR analysis on liver IGF-I mRNA levels in Nile tilapia

給尼羅羅非魚注射雄激素 MT,雄魚肝臟 IGF-I mRNA的表達有顯著提高,該結(jié)果與前人研究報道一致。注射T、11-KT后,不影響銀大麻哈魚血清中GH水平,但顯著提高血清中IGF-I、IGFBP-3的水平,提示血清中IGF-I水平的變化是性類固醇激素直接作用的結(jié)果,而非通過 GH來實現(xiàn);亦或是通過提高肝臟對GH的敏感性來實現(xiàn),也可能是因為提高了血清中IGFBP-3的水平(Larsen et al,2004)。

E2可提高性未成熟金魚和虹鱒血清GH水平,一方面,E2可能通過影響下丘腦生長激素釋放抑制因子(Somatotropin Release Inhibiting Factor,SRIF)及其受體來調(diào)節(jié)垂體GH的釋放;另一方面,E2可能通過增大垂體中 GH細胞對下丘腦生長激素釋放激素(Growth Hormone Releasing Hormone,GHRH)的敏感性來促進垂體 GH的分泌,使血清中 GH水平上升(Holloway et al,1997;Zou et al,1997)。切除成熟雌鼠的卵巢(去除了內(nèi)源性 E2),鼠血清中 IGF-I的水平會上升,這時,若加入外源的 E2則會使血清中的 IGF-I水平降低,并且會抑制肝細胞的 IGF-I mRNA表達,使生長變慢(Borski et al,1996)。去勢雄兔和性未成熟南方鲇經(jīng)E2處理后,肝臟GHR mRNA水平都顯著下降(Yu et al,1996;章力等,2006)。在本次研究中,尼羅羅非魚注射雌激素 E2可明顯提高雌魚垂體 GH mRNA的水平,促進了垂體GH的合成。E2還促進尼羅羅非魚雌魚肝臟GHR1和IGF-I mRNA的表達,使生長軸上調(diào),生長速度加快;相反,E2顯著抵制雄魚的生長和生長軸相關(guān)基因的表達,一方面,可能是E2能使雄魚垂體的GH分泌模式雌性化,進而使其生長模式也雌性化,生長速度變慢;另一方面,可能是 E2顯著降低了雄魚肝臟GH和GHR mRNA的水平,使生長軸下調(diào),生長速度變慢。

性類固醇激素對尼羅羅非魚的生長及生長軸相關(guān)基因的表達有一定的影響作用,并且這種作用表現(xiàn)出明顯的雌雄差異性,提示雄魚和雌魚體內(nèi)的性類固醇激素水平不同有可能是引起雌魚和雄魚生長差異顯著、個體差異明顯的另一內(nèi)在原因。

馬細蘭,張 勇,劉曉春等,2010.半胱胺鹽酸鹽(CSH)對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長及生長軸相關(guān)基因表達的影響.海洋與湖沼,41(2): 240—245

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