李海艷，辛嘉英，王艷，王喜軍，馬杰，邢志華

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈藥集團(tuán)制藥總廠，黑龍江 哈爾濱 150086

萘普生［naproxen，化學(xué)名為2-（6-甲氧基-2-萘基）丙酸］，是一種2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥物。具有解熱、消炎、鎮(zhèn)痛的作用，主要治療風(fēng)濕性脊椎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及產(chǎn)后、術(shù)后止痛等，在臨床上應(yīng)用廣泛。研究證明，萘普生存在一對光學(xué)活性對映體，（S）-萘普生的藥效是（R）-萘普生的28 倍，且（R）-萘普生與輔酶A 會(huì)形成酯，擾亂人體正常的膜功能及脂代謝等，給人體帶來一定的毒副作用。因此，為了用藥安全，在臨床上須使用純S型萘普生。所以，研究一種高效、低成本拆分萘普生的方法就變得非常重要[1-4]。

目前，外消旋萘普生的主要拆分方法有誘導(dǎo)結(jié)晶法、化學(xué)拆分法、色譜法、酶促拆分法等[5-6]。誘導(dǎo)結(jié)晶法步驟繁瑣，操作條件不易控制，單程收率較低，且易因?qū)τ丑w濃度增加而導(dǎo)致夾帶析出的現(xiàn)象；化學(xué)拆分法一直存在拆分劑篩選上的盲目性，采用的手性拆分試劑昂貴且消耗量大，生產(chǎn)成本較高并且會(huì)對環(huán)境造成污染；色譜法成本高，且主要用于分析與小規(guī)模制備，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[5-7]；酶促拆分技術(shù)因其具有選擇專一性強(qiáng)、反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件溫和、可降解無污染等優(yōu)點(diǎn)，受到了極大的關(guān)注[8-12]。在此，我們從酶的選擇、酶的固定化及反應(yīng)體系的構(gòu)建方面對萘普生的酶法拆分做簡要介紹。

1 酶的選擇

利用生物酶高選擇性催化萘普生拆分研究取得了較好的效果，但迄今為止發(fā)現(xiàn)的可高選擇性拆分外消旋萘普生的脂肪酶種類較少，其中，偏好S型異構(gòu)體的假絲酵母脂肪酶最常用。Sema 等應(yīng)用假絲酵母脂肪酶CRL進(jìn)行外消旋萘普生甲酯對映體的選擇性水解，在120個(gè)大氣壓、37℃下反應(yīng)2 h，獲得了最高的對映體比率，產(chǎn)物的對映體過量值eep=97.9%、底物的對映體過量值ees=68.8%時(shí)，對映體比率值E=193[13]。Eun 等用兩步丙酮處理的假絲酵母脂肪酶CRL 對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行選擇性水解，就水解反應(yīng)速率和對映體選擇性來說，最適反應(yīng)條件為37℃、pH6.0，經(jīng)過156 h的反應(yīng)后，38.4%的（R，S）-萘普生甲酯被水解了，表現(xiàn)出98%的對映體過量值，對映體比率值E＞100。最終，（S）-萘普生被從反應(yīng)混合物中分離出來，其光學(xué)純度達(dá)到98%，回收收益率達(dá)95%[14]。為了改變這種用酶單一的情況，近年來，研究人員積極開發(fā)其他種類的酶。Morrone等對南極假絲酵母脂肪酶、褶皺假絲酵母脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶等5 種脂肪酶進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)只有南極假絲酵母脂肪酶Novozym 435顯示所需R型異構(gòu)體，并利用Novozym 435進(jìn)行不可逆的酯化反應(yīng)，這一過程提供了萘普生的拆分，S型萘普生的對映體過量值達(dá)到了98%，產(chǎn)率為52%[15]。Lucia 等對適用于（R，S）-萘普生的對映體拆分的酯酶和脂肪酶進(jìn)行了篩選并對活性進(jìn)行了鑒別，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，從8種可行的商業(yè)化酶中選?。⊿）-萘普生對映體過量值大于98%、外消旋物底物轉(zhuǎn)化率大于40%、對映體比率值E＞100 的可用于優(yōu)化對映體選擇性的酶，結(jié)果顯示來源于ChiroCLEC-CR 和ESL001-01 的脂肪酶提供了較好的對映體過量值，但只有ChiroCLEC-CR 脂肪酶對對映體比率E 具有特異性[16]。Cheng 等發(fā)現(xiàn)蘊(yùn)含在粗木瓜蛋白酶中的番木瓜脂肪酶CPL，能夠在飽和（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯水溶液中對其進(jìn)行生物催化，使得進(jìn)行對映體選擇性水解。研究發(fā)現(xiàn)，在異辛烷中得到最大起始速率的溫度是60℃，這時(shí)脂肪酶具有很高的對映體選擇活性，對映體比率值E=122。對比番木瓜脂肪酶CPL 和細(xì)菌脂肪酶的酶活表現(xiàn)，結(jié)果表明，對于（S）-萘普生，番木瓜脂肪酶CPL 的對映體選擇性和活性更好，在60℃的異辛烷飽和水溶液中也更加穩(wěn)定[17]。而Liu 等從枯草芽孢桿菌ECU0554 中提出了（S）-對映體酯酶，命名為BsENP01，已在異源宿主大腸桿菌BL21中被克隆和過表達(dá)。BSE-NP01是相對分子質(zhì)量約32 000的羧酸酯酶，最適溫度和pH 值分別為50℃和8.5。它可以催化外消旋的萘普生甲酯選擇性水解（S）-對映體，得到（S）-萘普生對映體過量值為98%，在2 L規(guī)模的固體-水兩相系統(tǒng)中重復(fù)批量生產(chǎn)（S）-萘普生，在10 次完整的回收（R）-底物之后，平均總收率達(dá)85%[18]。Lucia 等使用異源表達(dá)的羧基酯酶NP 水解外消旋萘普生甲酯，在每克底物添加10單位酶的條件下，5 h 內(nèi)轉(zhuǎn)換率可達(dá)46.9%，產(chǎn)物的對映體過量值可達(dá)99%，對映體比率值E約為500[19]。

2 酶的固定化

為了提高酶的選擇性，保持酶的活性及穩(wěn)定性，便于酶的重復(fù)利用[20]，經(jīng)常應(yīng)用的方法就是對酶進(jìn)行固定化。崔玉敏等以中等極性大孔吸附樹脂HZ-806 作為固定化載體，利用柱狀假絲酵母脂肪酶選擇性催化（S）-萘普生酯發(fā)生水解，在中等極性大孔吸附樹脂固定化酶填充床反應(yīng)器中，連續(xù)水解拆分混旋乙氧基乙基萘普生酯，當(dāng)流量為72 mL/h時(shí)，酯的水解率為17%，光學(xué)純度為89.1%[21]。Lin 等用固定在聚丙烯粉末上的皺褶念珠菌脂肪酶在45℃的異辛烷中對（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯進(jìn)行對映體選擇性水解的生物催化過程，外消旋物底物轉(zhuǎn)換率為95.5%時(shí)，得到了較低的產(chǎn)物對映體過量值（eep=58.1%）。這也許是因堿的外消旋作用能力的減弱和非酶水解作用的增強(qiáng)所致[22]。Elif 等發(fā)現(xiàn)來源于石松的天然多聚物孢子花粉素具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對于化學(xué)攻擊具有非常高的抗性。將假絲酵母脂肪酶CRL 用化學(xué)惰性的溶膠-凝膠四乙氧基硅烷（TEOS）和辛基三乙氧基硅烷（OTES）包裹，對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行水解，結(jié)果表明，以孢子花粉素為基礎(chǔ)的封裝脂肪酶相較于無溶膠-凝膠包裹的脂肪酶，具有特別高的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性，對映體比率值E＞400，（S）-萘普生的光學(xué)純度達(dá)98%[23]。Serpil等將假絲酵母脂肪酶CRL固定于大網(wǎng)狀樹脂上，測定最佳水解外消旋萘普生甲酯的反應(yīng)條件。最佳的轉(zhuǎn)化率和對映體選擇性的條件是45℃、pH6，成功應(yīng)用于180 h 的連續(xù)批處理運(yùn)行中，在轉(zhuǎn)化率達(dá)到49%時(shí)取得了最高的對映體比率值E為174.2[24]。

近年來還有研究人員使用溶膠-凝膠的方法對脂肪酶進(jìn)行封裝。與其他固定矩陣相比，溶膠-凝膠法沒有任何共價(jià)修飾，特別容易制備。它還具有幾個(gè)優(yōu)勢：可以截留大量的酶，具有化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在手性芳香醇、羧酸和羧酸胺動(dòng)力學(xué)拆分中是一種優(yōu)秀的催化劑。Elif 等將假絲酵母脂肪酶CRL通過共價(jià)鍵合或者溶膠-凝膠封裝過程固定在戊二醛活化的氨基玻璃球上，在水相緩沖液/異辛烷反應(yīng)系統(tǒng)中對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行對映體選擇性水解，相較于共價(jià)固定化的脂肪酶，包入膠囊的玻璃球的脂肪酶對映體選擇活性要高，且顯示出優(yōu)異的對映體選擇性（E＞400），膠囊包裹脂肪酶的（S）-萘普生對映體過量值為98%，且包入膠囊的脂肪酶的活性比率達(dá)到了166.9，這比共價(jià)固定化的脂肪酶要高5.5倍[25]。Serkan等通過縮聚四乙氧基硅烷和正辛基三乙氧基硅烷將CRL 封裝在化學(xué)惰性溶膠-凝膠中，用于外消旋萘普生甲酯的對映體選擇性水解反應(yīng)，并與游離脂肪酶和共價(jià)固定化的脂肪酶進(jìn)行比較。結(jié)果表明，該封裝脂肪酶在動(dòng)力學(xué)拆分（R/S）萘普生甲酯的最適pH 值和溫度分別為7.0 和55℃，且具有良好的穩(wěn)定性、適應(yīng)性和可重用性[26]。Elif同樣將褶皺假絲酵母脂肪酶用溶膠-凝膠的方法封裝，將5，11，17，23-四叔丁醇-25，27-二（2-氨基吡啶）羰基甲氧基-26，28-二羥基環(huán)[4]芳基連接到磁性Fe3O4納米粒子（Calix-M-E），對這一封裝脂肪酶的催化活性進(jìn)行外消旋的萘普生甲酯的對映選擇性水解試驗(yàn)。相比于沒有載體包封的脂肪酶（E=137），Calix-M-E 有很大的催化活性和對映選擇性（E=400），以及顯著的可重用性[27]。Enise觀察到，將CRL用環(huán)[n]芳基羧酸衍生物封裝，F(xiàn)e3O4作為添加劑，進(jìn)行外消旋萘普生甲酯對映體選擇性水解反應(yīng)，pH7.0、35℃是最有效的水解條件，轉(zhuǎn)化率及對映體比率值E 分別能達(dá)到49%和525。除封裝脂肪酶的可重復(fù)性和可恢復(fù)性之外，酶的負(fù)擔(dān)能力也很重要[28]。Elif等將β-環(huán)糊精連接到磁性納米顆粒上，和褶皺假絲酵母脂肪酶一起被封裝到用烷氧基硅烷前體制作的溶膠-凝膠模型中。在水緩沖溶液/異辛烷反應(yīng)體系中對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行對映體選擇性水解，用磁性β-環(huán)糊精封裝的脂肪酶被觀察到優(yōu)異的對映體選擇性（E=399），（S）-萘普生的對映體過量值能達(dá)到98%[29]。Serkan 等將2 種類型的納米顆粒作為添加劑用于皺褶假絲酵母脂肪酶的包被，包被用了溶膠-凝膠法。第一種方法，納米粒子共價(jià)連接新合成的環(huán)[8]芳基八面體戊酸衍生物（C[8]-C4-COOH）產(chǎn)生新的環(huán)[8]芳烴裝飾磁鐵礦納米顆粒（NP-C[8]-C4-COOH），然后NP-C[8]-C4-COOH被作為添加劑使用在溶膠-凝膠包封過程中；另一種方法，氧化鐵納米粒子被直接添加到溶膠-凝膠封裝過程，與C[8]-C4-COOH和褶皺假絲酵母脂肪酶以靜電相互作用。對2 個(gè)新型封裝脂肪酶（Enc-NP-C[8]-C4-COOH和Enc-C[8]-C4-COOH@Fe3O4）在外消旋萘普生甲酯水解反應(yīng)中的催化活性和對映體選擇性進(jìn)行了評估，結(jié)果表明，當(dāng)脂肪酶被封裝在基于環(huán)芳烴的添加劑的存在下，脂肪酶的活性和對映選擇性得到改善。的確，同自由脂肪酶（E=137）相比，封裝脂肪酶具有優(yōu)秀的對映體選擇性，E 分別為371 和265。在重復(fù)使用5次之后，Enc-C[8]-C4-COOH@Fe3O4保留其初始活性的86%以上，而NP-C[8]-C4-COOH則可達(dá)到92%以上[30]。Ezgi 等合成了2 種新的低取代環(huán)[4]芳烴二酰胺衍生物（5 和6），使用它們在溶膠-凝膠封裝技術(shù)固定CRL，并對2個(gè)新包封的脂肪酶5-CRL 和6-CRL 的（R，S）-萘普生甲酯的水解動(dòng)力學(xué)拆分的活動(dòng)進(jìn)行了評價(jià)，（R，S）-萘普生甲酯的對映選擇性顯著改善，分別具有392和525的對映體比率。此外，與沒有載體的自由脂肪酶相比，5-CRL和6-CRL 還具有快速恢復(fù)的能力[31]。Enise 等將皺褶假絲酵母脂肪酶包封在溶膠-凝膠中，以環(huán)[4]芳烴肼或羧酸衍生物和Fe3O4磁性納米粒子作為添加劑。將包封的脂肪酶用于外消旋萘普生甲酯的對映選擇性水解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的活性和對映選擇性（E＞300）[32]。

3 反應(yīng)體系的構(gòu)建

酶法拆分萘普生，一般思路是先把外消旋萘普生轉(zhuǎn)化為外消旋萘普生酯，再利用酶高選擇性地將（S）-萘普生酯水解成（S）-萘普生，從而達(dá)到拆分的目的。研究人員想找到一種具有較高極性并可長期保持酶活性的溶劑，以保證反應(yīng)底物萘普生酯在反應(yīng)體系中有較高的溶解度，脂肪酶在催化拆分外消旋萘普生時(shí)表現(xiàn)出良好的酶促轉(zhuǎn)化效率。Hernáiz等發(fā)現(xiàn)在水解（R，S）-2-芳基丙酸乙酯時(shí)使用橄欖油作為基質(zhì)，相對于無外部陽離子條件，有二價(jià)和/或一價(jià)陽離子（Na+或Ca2+）時(shí)會(huì)增加脂肪酶活性[33]。María 等使用商業(yè)化粗酶（LC）及半純化的念珠菌假絲酵母脂肪酶（LS），對（R，S）-2-芳基丙酸酯進(jìn)行對映選擇性水解，并在反應(yīng)體系中加入乳糖（24 h），發(fā)現(xiàn)2 種酶同時(shí)增加活性，但半純化的脂肪酶活性更高[34]。Xin 等使用光分解的甲醇對萘普生甲酯的對映體進(jìn)行選擇性水解，甲醇被光催化生成水，酯催化水解的平衡常數(shù)（K）會(huì)被改變。平衡獲得量和對映體過量值會(huì)被升高。因?yàn)橹久覆粫?huì)在有機(jī)溶劑中溶解，它被吸附在光催化劑顆粒上，這可能促進(jìn)酶從反應(yīng)系統(tǒng)中隔離出來[35]。周彩榮等用氫氧化鈉水溶液水解2-甲氧基-6-（2'-萘基）丙酸-（2″，2″-二甲基-3″-溴）丙酯得到萘普生，在水解溫度（110±5）℃、水解反應(yīng)時(shí)間60～90 min、w（NaOH）=40%、n（氫氧化鈉）∶n（原料）=4.4∶1 的條件下，萘普生收率可達(dá)99.19%[36]。鞠培培等、趙永杰等分別利用擬低共熔體系及離子液-水體系，不同程度地提高了水解拆分反應(yīng)效率，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑體系相比，此2種體系均對環(huán)境友好[37-38]。Dean等在生物催化反應(yīng)中添加聚乙二醇（PEG）1000 作為共溶劑，能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化率提升10 倍，最佳反應(yīng)條件是底物濃度為10%（m/v）、酶和底物的比率為1:50、50℃、pH5、添加41%的PEG 1000。盡管動(dòng)力學(xué)得到了改善，但在這些條件下的生物催化活性不高，限制了能夠循環(huán)的次數(shù)[39]。Chen 等在飽和水溶液中利用海氏番木瓜的粗脂肪酶對（R，S）-萘普生2，2，2-三氟乙酯的對映體選擇性生物催化水解，將該酶的表現(xiàn)與番木瓜脂肪酶進(jìn)行對比，2 種脂肪酶都表現(xiàn)出了對親水性溶劑的較低耐受性，同時(shí)它們的活性也能被（S）-萘普生2，2，2-三氟代乙醇抑制，2 種部分純化脂肪酶都可使酶活性和對映體選擇性得到改善[40]。Giorno 等研究了-OR酯基長度對催化劑活性和游離酶對映體選擇性的影響，發(fā)現(xiàn)酶的對應(yīng)體選擇性及活性與-OR 基團(tuán)中碳原子的數(shù)量逆相關(guān)，對于固定化酶來說這意味著對一個(gè)生產(chǎn)體系合適底物進(jìn)行選擇取決于目的產(chǎn)物的純度和對映體旋光性之間的平衡[41]。辛嘉英等利用選擇性相反的2種脂肪酶對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行選擇性拆分，制備高光學(xué)純度（S）-萘普生。先利用R選擇性的固定化南極假絲酵母脂肪酶Novozym 435對外消旋萘普生甲酯進(jìn)行第一次拆分，然后用S選擇性的固定化南極褶皺假絲酵母脂肪酶CRL對S過量的剩余底物萘普生甲酯在同樣的反應(yīng)體系中進(jìn)行第二次拆分，最后得到對映體過量值為96.8%的（S）-萘普生，產(chǎn)率達(dá)19.9%[42]。

4 結(jié)語

萘普生的酶法拆分既有優(yōu)點(diǎn)，又有許多不足之處，如酶的處理、拆分劑及拆分體系的選擇，拆分過程的熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué)研究等，都還需要進(jìn)一步探索。但可以預(yù)見，伴隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，以及近年酶法的不斷進(jìn)步，人們對各種對映體拆分機(jī)制更為深入的研究，酶法拆分技術(shù)必將更加完善。

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