楊明璨，熊鴻燕，林 輝 (.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部人體解剖學(xué)教研室，重慶40008;.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室，重慶40008;.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院熱帶研究所，重慶40008)

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病，糖尿病的心血管病變是其最常見的一種并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因［1-3］。因此糖尿病患者對(duì)組織工程血管的需求十分大，然而高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損使得組織工程血管在糖尿病患者手術(shù)移植后通暢率很低，因此維持內(nèi)皮細(xì)胞在高糖狀態(tài)下的正常功能對(duì)于保持組織工程血管的通暢具有十分重要的意義［4］。AKT 通路是血管生成過程中至關(guān)重要的一個(gè)信號(hào)通路，研究表明它的阻斷可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF 和SDF-1 等促血管生成因子［5］。羅格列酮(Rosiglitazone)是一種降血糖藥物，研究表明其具有控制血糖和改善胰島素抵抗的作用［6］，此外也有文獻(xiàn)報(bào)道羅格列酮可減輕心肌缺血、抑制炎癥，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥有一定的預(yù)防和治療作用［7-8］。然而目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道羅格列酮對(duì)高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制血栓形成和內(nèi)膜增生的重要作用，然而高血糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞受到直接損傷，致使其功能發(fā)生紊亂，因此維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能對(duì)于組織工程血管的替代治療具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，通過觀察羅格列酮對(duì)高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞促血管生成功能的影響，探討其對(duì)糖尿病條件下病變血管替代治療的潛在意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

羅格列酮(Sigma)，RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone 公司，美國)，胎牛血清(Hyclone 公司，美國)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)、ELISA 試劑盒皆購于廈門慧嘉生物科技有限公司，Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室(Corning 公司)，4%多聚甲醛(Boster 公司)，0.5%結(jié)晶紫(Sigma)，AKT 抑制劑triciribine(Sigma)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購自ATCC (美國)。使用RPMI-1640 培養(yǎng)基，10%胎牛血清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含5.6 mmol 和30 mmol 葡萄糖做為HUVEC 低糖和高糖培養(yǎng)基［8］，5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。采用加入低糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)方法為對(duì)照組、加入高糖培養(yǎng)基為高糖組、高糖組加入10 μmol 羅格列酮［9］為羅格列酮組，AKT 信號(hào)通路抑制組為在加入羅格列酮的同時(shí)加入5 μmol 的triciribine。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 我們采用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC 的增殖能力［10］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，用胰酶消化后，按照4 000個(gè)/孔的密度傳代到96 孔板中。細(xì)胞貼壁后，根據(jù)對(duì)HUVEC的分組給予因子刺激。24 h 后，每孔加入20 μl 的5 mg/mL MTT，37 ℃孵育4 h，去上清后每孔加入150 μl DMSO。使用Emax 酶標(biāo)儀(Molecular Devices)，OD490 nm 處測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將HUVEC 種植于6 孔板中，待其長(zhǎng)滿，除對(duì)照組采用0.1%FBS 的正常培養(yǎng)基外，其余3 組均用0.1%FBS的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取已消毒的P1000 槍頭，垂直進(jìn)行細(xì)胞劃痕［11］，清洗去除劃下的細(xì)胞。按照實(shí)驗(yàn)分組給予因子刺激，之后放入37 ℃，5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS 洗3 次后，用4%多聚甲醛固定后0.5%結(jié)晶紫對(duì)其染色。OLYMPUS BX50 顯微鏡(Japan)拍攝劃痕圖像(40 ×)，使用IPP 軟件(Media Cybernetics)測(cè)量0 h 以及24 h 的細(xì)胞創(chuàng)痕面積。

1.2.4 培養(yǎng)基中細(xì)胞因子檢測(cè) 3 組HUVEC 于5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，將各組培養(yǎng)基用0.22 μm 針式濾器抽濾，采用RD 公司生產(chǎn)的ELISA 試劑盒，檢測(cè)各組培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1 的含量，進(jìn)行的各種操作嚴(yán)格按照說明書上進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，描述性數(shù)據(jù)采用平均值和百分比分析表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)閉合率，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對(duì)HUVEC 增殖的影響

從圖1 可以看出相對(duì)于對(duì)照組，高糖可以顯著抑制HUVEC的增殖，使細(xì)胞的增殖速率下降了55%;羅格列酮可以降低高糖對(duì)HUVEC 增殖的抑制作用，使細(xì)胞的增殖速率增加了102%;而AKT 抑制劑阻斷了羅格列酮對(duì)HUVEC 增殖的影響，使其增殖速率下降了58%，各組之間差異明顯，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 羅格列酮對(duì)HUVEC 遷移的影響

我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)研究羅格列酮對(duì)HUVEC 遷移的影響。圖2 結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，高糖組的HUVEC 的劃痕閉合面積下降了52%。羅格列酮降低了高糖對(duì)HUVEC 遷移功能的影響，使HUVEC 的劃痕閉合面積相對(duì)于高糖組增加了64%。AKT 信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮著十分重要的作用，AKT 信號(hào)通路的阻斷降低了羅格列酮對(duì)HUVEC 遷移的促進(jìn)作用，HUVEC 的劃痕閉合面積是羅格列酮組的21%。各組之間差異明顯，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1 含量的測(cè)定結(jié)果

用ELISA 試劑盒對(duì)各組培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖3，從圖中可以看出羅格列酮組培養(yǎng)基里VEGF、SDF-1的含量分別是高糖組的3.2 倍和3 倍。而AKT 抑制組中VEGF、SDF-1 的含量分別是羅格列酮組的1/2 和1/3。各組之間差異明顯，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。這提示在高糖環(huán)境中，羅格列酮藥物可以促進(jìn)HUVEC 分泌細(xì)胞因子VEGF、SDF-1 分泌。AKT 信號(hào)通路的阻斷抑制了羅格列酮對(duì)HUVEC 細(xì)胞因子的作用效果。

圖1 羅格列酮對(duì)HUVEC 增殖的影響

圖2 羅格列酮對(duì)HUVEC 遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)

圖3 培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1 含量

3 討論

目前全球糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病率逐年升高，而它在微血管病變和動(dòng)脈硬化的基礎(chǔ)上能產(chǎn)生多種慢性并發(fā)癥，糖尿病的血管病變則是引起患者致殘甚至致死的首要原因［12］。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制血栓形成和內(nèi)膜增生的重要作用，因此在組織工程血管移植后長(zhǎng)期通暢的維持中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。然而高血糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞受到直接的損傷，使其功能發(fā)生紊亂，所以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能對(duì)于組織工程血管的替代治療具有十分重要的意義。在心血管系統(tǒng)的發(fā)生和重建過程中，PI3K-Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是至關(guān)重要的，研究［13］表明它的阻斷可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF 和SDF-1 等促血管生成因子，通過研究證實(shí)AKT 信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。

羅格列酮作為降血糖藥物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療緩解，國外文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道羅格列酮可以具有減輕心肌缺血、抑制炎癥、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，并對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥有一定的預(yù)防和治療作用，然而在高糖環(huán)境下羅格列酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響尚不明確。在實(shí)驗(yàn)中，我們使用降糖藥物羅格列酮作用于高糖環(huán)境培養(yǎng)的HUVEC，研究發(fā)現(xiàn)在羅格列酮組在藥物作用的影響下，HUVEC 的增殖明顯高于高糖組。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，羅格列酮組的HUVEC 劃痕閉合率同樣高于高糖組，并且效果十分明顯?？梢娫诟咛黔h(huán)境下，降糖藥物羅格列酮能夠促進(jìn)HUVEC 的增殖和遷移，而增殖、遷移以及旁分泌是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促血管生成功能的重要機(jī)制。國外已有研究［16］表明，VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、SDF-1(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)均能刺激血管的形成，其中VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性生長(zhǎng)因子，是現(xiàn)階段最有效的血管生成因子，能增加血管通透性，促進(jìn)HUVEC 分裂和增殖，和血管新生密切相關(guān)。SDF-1 可以促進(jìn)HUVEC 增殖，加速血管生成［17］。各組培養(yǎng)基采用ELISA 檢測(cè)的方法，顯示出羅格列酮組VEGF、SDF-1 含量明顯高于高糖組。這再次證實(shí)了相關(guān)結(jié)論，并且提示我們高糖環(huán)境下羅格列酮不僅能夠促進(jìn)HUVEC 的增殖和遷移，同時(shí)在旁分泌方面也起著促進(jìn)HUVEC 分泌相應(yīng)的細(xì)胞分子的作用，對(duì)血管新生有著重要的影響。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)降糖藥物羅格列酮可以在高糖環(huán)境下保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖環(huán)境的損傷，維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常促血管生成功能。因此，我們認(rèn)為羅格列酮可以作為組織工程血管移植后的一種治療藥物，在降低血糖的同時(shí)保護(hù)遷移到組織工程血管表面的內(nèi)皮細(xì)胞正常功能。

綜上所述，通過羅格列酮對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究表明，此藥物對(duì)高糖環(huán)境下的HUVEC有著活化作用，ATK 信號(hào)通路在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，而這種活化作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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