孫 鑫，楊 芳，鄧洋洋，鄭洪新△，王擁軍

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110847; 2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院，上海 200032)

補腎、健脾、活血方法對骨質(zhì)疏松癥小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量影響*

孫 鑫1，楊 芳1，鄧洋洋1，鄭洪新1△，王擁軍2

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110847; 2．上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院，上海 200032)

目的:觀察補腎、健脾、活血方法對骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的影響，探討中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。方法:實驗藥物灌胃8周后，ELISA法測定股骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量。結(jié)果:補腎組、福善美組小鼠骨骼及骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶較模型組明顯升高。結(jié)論:骨質(zhì)疏松癥的形成可能與骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量異常有關(guān);補腎、健脾方法通過調(diào)控骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶含量，起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

骨質(zhì)疏松癥;骨骼肌;Ca2+-Mg2+-ATP酶

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險性增高的一種全身性骨骼疾?。?］。本實驗通過觀察其骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，探討骨質(zhì)疏松癥“骨肉不相親”的病理機制，即骨骼肌收縮與骨骼協(xié)調(diào)性對骨質(zhì)疏松癥形成的影響，并觀察補腎方法、健脾方法、活血化瘀方法對骨質(zhì)疏松癥的防治效果和作用機制。

1 材料

1.1 動物

骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)基因敲除純合子小鼠36只，8周齡，品系C57BL/6J，來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所。野生型小鼠8只，品系C57BL/6J，來源于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥物

補腎中藥由鹿茸凍干粉與淫羊藿提取物微粉及牡蠣納米鈣微粒混合即得;健脾中藥為補中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司，批號090101)，活血中藥為身痛逐瘀湯(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院)，陽性對照藥為福善美(杭州默沙東制藥有限公司，批號J20080073)，ELISA相關(guān)試劑(Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒，美國ADL公司)。

2 方法

2.1 分組

野生型小鼠8只為正常組，OPG基因敲除小鼠36只按隨機數(shù)字表法分為模型組8只，補腎組、健脾組、活血組、福善美組各7只。

2.2 給藥

正常組及模型組小鼠正常飲食并給予純凈水灌胃，其他各組正常飲食并給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次共8周。藥物劑量:小鼠等效劑量按成人(60 kg體質(zhì)量)每日用藥量的9倍計算［2］，容積為1ml/100 g體質(zhì)量，補腎組給藥量為鹿茸的0.320 g·kg－1· d－1，牡蠣0.256 g·kg－1·d－1，淫羊藿0.126 g·kg－1· d－1;健脾組給藥量0.901 g·kg－1·d－1，活血組給藥量9.010 ml·kg－1·d－1，福善美給藥量1.5016 mg· kg－1·d－1。實驗期間各組小鼠每周稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

2.3 取材

實驗小鼠在最后1次灌胃后，禁食24 h后取材。本實驗保留標(biāo)本包括右后肢腓腸肌的白肌部分和左后肢的全股骨(置塑料保鮮袋內(nèi)－70℃凍存)。

2.4 ELISA法檢測

將骨、骨骼肌分別放入約5倍于組織體積量的MSH緩沖液中清洗，擦干稱重后，用剪刀剪碎置入勻漿瓶中，以500 rpm勻漿充分;將勻漿后的組織放入離心管中離心，2000 g×10 min;提取上清液放入1 mlEP管中，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 模型評價

表1顯示，運用雙能X線吸收法對小鼠離體股骨上1/3進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠離體股骨上1/3骨密度極顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，各治療組大鼠股骨上1/3骨密度均有不同程度升高，其中以補腎中藥組升高最為顯著(P＜0.01)，其次為健脾組(P＜0.01)，說明OPG基因敲除小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，故模型成功。

3.2 骨保護素基因敲除小鼠骨骼、骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶檢測結(jié)果

表2顯示，與正常組比較模型組、健脾組和活血組小鼠骨骼的 Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補腎組、福善美組小鼠骨骼Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯升高(P＜0.01)，健脾組和活血組亦升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠股骨上1/3骨密度比較

表2顯示，與正常組比較，模型組、健脾組和活血組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低(P＜0.01)，補腎組和福善美組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，補腎組、福善美組小鼠骨骼肌的Ca2+-Mg2+-ATP酶明顯升高(P＜0.01)，健脾組和活血組亦升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比較(±s)

表2 各組小鼠骨骼及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶(mg/L)比較(±s)

注:同表1

組 別 小鼠數(shù) 骨骼 骨骼肌正 常 組8 11.071±1.03 4.512±0.38模 型 組 8 2.121±0.14* 1.851±0.11*補 腎 組 7 9.003±1.31＊▲ 5.871±0.48＊▲健 脾 組 7 2.436±0.22*# 2.053±0.04*#活 血 組 7 2.401±0.09*# 2.001±0.18*#福 善 美 組 7 9.076±0.69＊▲ 7.413±0.64＊▲

4 討論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制復(fù)雜，肌肉無力，骨骼與肌肉運動不相協(xié)調(diào)，可能是其發(fā)病機制之一，因此本實驗以此為切入點進(jìn)行研究。Ca2+-Mg2+-ATP酶與肌肉收縮及能量代謝有著密切聯(lián)系。該酶活性下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載激惹出現(xiàn)一系列代謝紊亂，可致結(jié)構(gòu)退變甚至喪失生命力，出現(xiàn)整個肌細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致骨骼肌損傷［3］，而骨的負(fù)荷主要來源于肌肉的主動收縮。因此，增加肌肉的力量、彈性及身體的協(xié)調(diào)性和平衡性，可以加強骨形成和肌肉對骨骼的支持力量，進(jìn)而減少骨質(zhì)疏松癥患者骨折的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量。楊芳等研究顯示，不同中醫(yī)治法對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶存在相應(yīng)的影響［4］。本實驗結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥小鼠骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶顯著降低，可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機制之一，運用不同的中藥進(jìn)行干預(yù)后，Ca2+-Mg2+-ATP酶有不同程度的升高，其中補腎中藥效果最好，其次為健脾中藥。先天生后天，后天養(yǎng)先天，腎藏精主骨生髓，脾主運化主肌肉。若脾氣健運則精微充足，肌肉得養(yǎng)，腎精亦能得到充養(yǎng)，先天充盛，精充髓足則骨骼強勁;反之，脾胃虛損則四肢百骸失養(yǎng)，肌肉無力，可發(fā)為骨痿。因此，通過補腎、健脾法改善骨及骨骼肌中Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量，可能是補腎、健脾中藥防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制之一。

［1］劉忠厚．骨質(zhì)疏松學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，1998:142．

［2］施新猷．醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)［M］．陜西:科學(xué)技術(shù)出版社，1989．

［3］徐雷，楊磊，杜柳濤，等．靜態(tài)負(fù)荷對大鼠離體骨骼肌能量代謝的影響［J］．中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2005，18(1):14-15．

［4］楊芳，鄭洪新，王劍，等．中醫(yī)不同治法對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度及骨骼肌Ca2+-Mg2+-ATP酶影響的比較研究［J］．中國骨質(zhì)疏松雜志，2011，17(1):56-59．

Effect of Bushen Jianpi Huoxue Method to the Ca2+-Mg2+-ATP，enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice

SUN Xin1，YANG Fang1，DENG Yang-yang1，ZHENG Hong-xin1△，WANG Yong-jun2

(1．Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China; 2．Longhua Hospital of Shanghai University of TCM，Shanghai 200032，China)

Objective:To observe the effects of tonifying kidney，tonifying spleen，promoting blood flow therapies on Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content of bone and skeletal muscle in osteoporosis mice，so as to investigate the mechanism of traditional Chinese medicine in prevention and treatment of osteoporosis．Methods:Intragastric administration was the way of medication for 8 weeks，and then the bone and skeletal muscle were taken to detemermine the content of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme by ELISA method．Results:the bone and the skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme content increased significantly in the tonifying kidney medicine group and the Fosamax group．Conclusion:The formation of osteoporosis may be related to abnormal content of bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．The tonifying kidney method，tonifying spleen method are of a preventive effect on osteoporosis through the regulation of content of osteoporosis mice bone and skeletal muscle Ca2+-Mg2+-ATP enzyme．

Osteoporosis;Skeletal muscle;Ca2+-Mg2+-ATP enzyme

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0416-02

2015-01-11

國家自然科學(xué)基金青年基金(81001485);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2010CB530401);遼寧省教育廳高校杰出青年學(xué)者成長計劃(LJQ2012084)

孫 鑫(1981-)，女，遼寧鐵嶺人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)病因病機理論研究。

△通訊作者:鄭洪新，Tel:024-31207101，E-mail:zhenghx2002 @126．com。