邵 妍，王鵬琴，王樹東，李超華

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110033)

眼針運(yùn)動療法對腦缺血再灌注大鼠腦缺血半暗帶區(qū)VEGF蛋白及VEGFmRNA表達(dá)的影響*

邵 妍1，2，王鵬琴2，王樹東1，李超華1

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110033)

目的:觀察眼針運(yùn)動療法對腦缺血再灌注(MCAO)模型大鼠大腦缺血半暗帶區(qū)域腦組織內(nèi)VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)的影響。方法:采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、假手術(shù)組、模型復(fù)制組。對模型復(fù)制組大鼠采用線栓法進(jìn)行腦缺血再灌注模型復(fù)制，再將模型復(fù)制組按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組、眼針組、眼針加運(yùn)動組，分別進(jìn)行眼針、眼針運(yùn)動療法干預(yù)治療，采用RT-PCR及western-blot法對各組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1/2基因及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果:與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針運(yùn)動療法組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高;與模型對照組比較，眼針組及眼針運(yùn)動療法組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高;眼針運(yùn)動療法組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于眼針組。結(jié)論:眼針運(yùn)動療法能夠促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)半暗帶組織中血管的新生，加快側(cè)枝循環(huán)的建立，實(shí)現(xiàn)其腦保護(hù)作用。

眼針療法;眼針運(yùn)動療法;腦缺血再灌注;血管內(nèi)皮生長因子;側(cè)枝循環(huán)

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，占腦血管病發(fā)病率80%左右，其病死率、復(fù)發(fā)率、致殘率在我國死亡率中僅次于惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康［1-2］。眼針運(yùn)動療法是我的導(dǎo)師王鵬琴教授在眼針療法基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)建，即中風(fēng)患者在眼針針刺同時(shí)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。目前，眼針運(yùn)動療法治療腦卒中在我院康復(fù)中心應(yīng)用已3年余，治療腦卒中患者500多名，該方法能明顯改善中風(fēng)后遺癥患者的臨床癥狀且療效顯著，明顯提高其生活質(zhì)量。近年來，眼針在治療缺血性腦血管病方面收到了一定的療效，但其機(jī)理尚不明確［3］，而關(guān)于眼針運(yùn)動療法的實(shí)驗(yàn)研究國內(nèi)尚未有相關(guān)報(bào)道。

本研究以眼針運(yùn)動療法為干預(yù)因素，對腦缺血再灌注模型大鼠進(jìn)行治療，以觀察VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平的變化，為眼針運(yùn)動療法治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

健康SPF級SD大鼠70只，雌雄不限，體質(zhì)量(280±20)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號SCXK(遼)2010-0001)。自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度18～22℃，相對濕度45%。

總 RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司，VEGF及VEGFR1/2引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司代為合成。親和純化兔抗大鼠VEGF及VEGFR1/2多克隆抗體購自 abcam公司，羊抗兔二抗、蛋白marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

①實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)數(shù)字法將70只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組(10只)、假手術(shù)組(10只)、模型復(fù)制組(50只)3組。對模型復(fù)制組大鼠采用線栓法進(jìn)行腦缺血再灌注模型復(fù)制，再將模型復(fù)制成功的40只大鼠(模型復(fù)制50只，失敗9只，模型評價(jià)1只)按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，分別為模型對照組(14只)、眼針組(13只)、眼針運(yùn)動療法組(13只);②模型制備與評價(jià)參照馬賢德等人的研究方法［4］，對模型復(fù)制組50只大鼠采用改良線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。模型的評價(jià)參照ZeaLonga 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)［2］:0分:無癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識喪失。評分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除;③ 眼針取穴及針刺手法:取13 mm毫針，眼針組于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法［3-4］，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)(見圖1)。針刺手法:從眼眶邊緣1 mm部位平刺，左眼按照順時(shí)針方向(右側(cè)按逆時(shí)針方向)，從該穴區(qū)起始定位線向終止定位線進(jìn)針，進(jìn)行平刺操作，刺入真皮達(dá)到皮下組織，進(jìn)針3 mm，到終止定位線為止。留針20 min，留針10 min時(shí)用刮柄進(jìn)行刮針1次，刮針5下。治療時(shí)機(jī):眼針組于腦缺血再灌注后1 h即開始針刺，每隔8 h進(jìn)行1次，缺血72 h后進(jìn)行樣本采集，采集樣本前30 min進(jìn)行末次針刺，共計(jì)9次針刺干預(yù)?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組和模型對照組不做針刺干預(yù);④ 眼針運(yùn)動療法:眼針運(yùn)動療法組大鼠在眼針治療同時(shí)在跑步機(jī)上進(jìn)行訓(xùn)練，時(shí)間為30 min，跑步機(jī)速度為5 m/min，坡度為0度，每日2次;⑤ 指標(biāo)測定模型復(fù)制后2 h，根據(jù)ZeaLonga 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)體征評分并分析。模型復(fù)制2 h后，于空白對照組、假手術(shù)組和模型復(fù)制組大鼠中各隨機(jī)抽取1只，斷髓處死后取出整個腦組織，采用TTC染色方法觀察腦缺血壞死灶發(fā)生情況。各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)(Western blot法):末次針刺后10 min，各組大鼠隨機(jī)抽取8只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，斷頭取出整個腦組織去掉小腦，觀察大腦軟化灶范圍，用手術(shù)刀柄鈍性剝離去除液化的腦組織，沿梗死灶邊緣切取1 mm寬的半暗帶腦組織(空白對照組和假手術(shù)組切取顳葉大腦皮層組織)，按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10000 r/min進(jìn)行離心，離心15 min分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍(lán)法對各組總蛋白進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣20 ug總蛋白進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗(1∶200) 4℃孵育過夜，二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，膠片曝光，掃描膠片，并于凝膠成像分析系統(tǒng)中測定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值作為該例樣本的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)(RTPCR法):采用RT-PCR方法對各組大鼠腦缺血半暗帶組織VEGF、VEGFR1/2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA引物序列如下:擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像并測定目的基因及內(nèi)參基因條帶的積分光密度值，以目的基因積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列表

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 模型評價(jià)結(jié)果

與空白對照組比較，模型復(fù)制組大鼠行為學(xué)評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);與假手術(shù)組比較，模型復(fù)制組大鼠行為學(xué)評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。

表1圖1顯示，全腦組織TTC染色結(jié)果顯示，模型復(fù)制組大鼠出現(xiàn)明顯梗死灶，而空白對照組和假手術(shù)組未見梗死灶出現(xiàn)。

2．2 各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織VEGF、VEGFR1/2蛋白表達(dá)結(jié)果

表2、圖2～4顯示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針加運(yùn)動組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0．01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型對照組比較，眼針組及眼針加運(yùn)動組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0．05或0．01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;眼針加運(yùn)動組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平高于眼針組(P＜0．05)

表2 各組大鼠行為學(xué)評分(±s)

表2 各組大鼠行為學(xué)評分(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與假手術(shù)組比較:#P＜0．01

組 別 例數(shù) 行為學(xué)評分空白對照組10 0．000±0．000假 手 術(shù) 組 10 0．100±0．316模型復(fù)制組 41 2．244±0．624*#

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色

表3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平(±s)

表3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與模型對照組比較:#P＜0．05，##P＜0．01;與眼針組比較:△P＜0．05

組蛋白表達(dá)水平(灰度值比值) VEGF VEGFR1 VEGFR2空白對照組別例數(shù)6 0．191±0．016 0．209±0．014 0．257±0．020假 手 術(shù) 組 6 0．180±0．021 0．217±0．014 0．252±0．018模型 對 照 組 6 0．308±0．026* 0．348±0．022* 0．377±0．024*眼 針 組 6 0．336±0．014*# 0．370±0．020*# 0．412±0．020*##眼針加運(yùn)動組 6 0．365±0．018*##△0．391±0．014*##△ 0．438±0．022*##△

圖2 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF蛋白表達(dá)注:1．空白對照組;2．假手術(shù)組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

圖3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR1蛋白表達(dá)注:1．空白對照組;2．假手術(shù)組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

2．4 各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織VEGF、VEGFR1/2 mRNA表達(dá)結(jié)果

表3、圖5～7顯示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針加運(yùn)動組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0．01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型對照組比較，眼針組及眼針加運(yùn)動組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0．01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;眼針加運(yùn)動組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平高于眼針組(P＜0．05)。

圖4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR2蛋白表達(dá)注:1．空白對照組;2．假手術(shù)組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

表4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平(±s)

表4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與模型對照組比較:#P＜0．01;與眼針組比較:△P＜0．05

組 別 例數(shù)蛋白表達(dá)水平(積分光密度比值) VEGF mRNA VEGFR1 mRNA VEGFR2 mRNA空白 對照 組6 0．195±0．029 0．220±0．030 0．250±0．029假 手 術(shù) 組 6 0．192±0．033 0．228±0．026 0．252±0．025模型 對 照 組 6 0．321±0．029* 0．358±0．038* 0．425±0．055*眼 針 組 6 0．401±0．027*# 0．459±0．050*# 0．509±0．066*#眼針加運(yùn)動組 6 0．442±0．033*#△ 0．515±0．056*#△ 0．567±0．053*#△

圖5 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF mRNA表達(dá)注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術(shù)組; 3．模型對照組;4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

圖6 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR1 mRNA表達(dá)注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術(shù)組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

3 討論

眼針療法［5-6］是彭靜山教授根據(jù)中醫(yī)理論和臨床探索創(chuàng)立的，經(jīng)過40余年的臨床應(yīng)用及不斷發(fā)展，具有完備的系統(tǒng)理論的一種特色微針療法?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》:“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其血?dú)饨陨嫌诿娑呖崭[，其精陽氣上走于目而為晴?！蓖蹩咸谩蹲C治準(zhǔn)繩》所載華佗論述:“目形類丸，瞳神居中而前，如日月之麗東南而晚西北也……故凡病發(fā)，則有形色絲絡(luò)顯現(xiàn)，而可驗(yàn)內(nèi)之臟腑受病也”，均為眼針的理論根據(jù)。我的導(dǎo)師課題組既往通過國家科技部973課題研究，創(chuàng)新提出“眼針八區(qū)十三穴絡(luò)腦通臟腑”的眼針核心理論。

康復(fù)訓(xùn)練對于腦卒中患者的治療效果還不理想，因此探索一個適合我國國情的康復(fù)治療體系，探尋康復(fù)治療腦卒中的有效方法是非常必要和急迫的［7］。近年來研究表明，針刺和康復(fù)訓(xùn)練［8-9］能夠改善腦卒中后認(rèn)知障礙，提高運(yùn)動功能和日常生活活動能力。

腦血管側(cè)支循環(huán)分三級:1級側(cè)支循環(huán)是前交通動脈(AComA)和后交通動脈(PComA);2級側(cè)支循環(huán)是眼動脈和軟腦膜側(cè)支;3級側(cè)支循環(huán)是新生血管，是目前研究熱點(diǎn)。如何有效地打開二級側(cè)支循環(huán)，促進(jìn)三級側(cè)支代償即新生血管的發(fā)生，良好的側(cè)支循環(huán)可減少梗死灶容積，改善預(yù)后，減低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，是目前臨床治療的研究方向［10-11］。眼針運(yùn)動療法治療腦卒中臨床療效顯著，其治療機(jī)制可能是通過上調(diào)MCAO模型大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)半暗帶組織中血管的新生，加快側(cè)支循環(huán)的建立，實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)是由Ferrara等于1989年在牛垂體濾泡星狀膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中純化而來，能夠參與血管新生，在目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)因子中，VEGF內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促血管構(gòu)建作用最強(qiáng)［12］。正常機(jī)體中，VEGF表達(dá)水平較低，而在病理?xiàng)l件下，VEGF無論是基因水平還是蛋白水平，均表現(xiàn)為過表達(dá)［13］。也有研究表明［14-15］，VEGF基因啟動子區(qū)包含HIF-1的反應(yīng)元件，缺血缺氧刺激可強(qiáng)效誘發(fā)VEGF及其受體的表達(dá)，也有人認(rèn)為缺氧因素可激活 c-Src，而 c-Src能偶上調(diào) VEGF的表達(dá)［16］。VEGF能夠增加血管的通透性，促進(jìn)血管外基質(zhì)沉淀，從而促進(jìn)血管新生［17］。

本研究在模型復(fù)制后，分別應(yīng)用眼針療法和眼針運(yùn)動療法治療，各組大鼠腦組織檢測結(jié)果顯示，腦缺血再灌注發(fā)生后，腦組織缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高。眼針和眼針運(yùn)動療法組治療后，三者表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)，眼針運(yùn)動組大鼠表達(dá)上調(diào)尤為明顯。

綜上所述，眼針療法及眼針運(yùn)動療法可以增加腦缺血再灌注損傷引起腦內(nèi)缺血半暗帶血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá)增高，從而促進(jìn)半暗帶組織中血管的新生，通過缺血半暗帶區(qū)域腦組織VEGF/ VEGFR信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)微血管的新生，從而加速側(cè)枝循環(huán)建立，改善腦部缺血，從而發(fā)揮對腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 為臨床進(jìn)一步應(yīng)用眼針運(yùn)動療法治療缺血性腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。

圖7 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR2 mRNA表達(dá)注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術(shù)組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運(yùn)動組

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Eye acupuncture with exercise to concentrate on cerebral ischemia and ischemia rats half dark stripe effect of VEGF protein expression and VEGFmRNA

SHAO Yan1，2，WANG Peng-qin2，WANG Shu-dong1，LI Chao-hua1

(1．Liaoning，Liaoning university of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110032，China; 2．Liaoning university Hospital of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110033，China)

Objective:to observe the needle eye exercise therapy on cerebral ischemia reperfusion(MCAO)model in the rat brain ischemia half dark area within the brain tissue VEGF，VEGFR1，VEGFR2 expression．Methods:using random number method，the SD rats were randomly divided into blank control group，control group，the model copy group．Copy the model group rats by using line switch on cerebral ischemia reperfusion model replication，and then copy model group were randomly divided into model control group，the eye，eye needle plus exercise group．Respectively，eye for eye needle exercise therapy intervention treatment，by the method of Rt-pcr and western blot-of VEGF，groups of rats had VEGFR1/2 for testing the level of gene and protein expression．Results:compared with blank control group，model control group and eye，eye needle group exercise therapy in ischemia rats half dark with VEGF in regional organizations，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Compared with model control group，group and eye eye needle exercise therapy group of VEGF in ischemia rats half dark band organization，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Needle eye exercise therapy in VEGF group rats had，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level is higher than eye needle group．Conclusion:pay close attention to again needle eye exercise therapy can promote brain ischemia injury after brain ischemia within half dark belt area of VEGF，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression，thus facilitating half dark with tissue，new blood vessels to speed up the establishment of collateral circulation，achieve the cerebral protective effect．

eye acupuncture;eye acupuncture with exercise therapy;Cerebral ischemia reperfusion;Vascular endothelial growth factor;Collateral circulation

R246．82

B

1006-3250(2015)04-0445-04

2015-01-11