鮑根生，張興旭，李秀璋，魏小星，李春杰

(1．草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020;2．青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016)

青海高原地處青藏高原東北部，位于31°39' －39°19' N，89°35' －103°04' E，平均海拔4 000 m 以上［1］。涵蓋亞熱帶常綠闊葉林、溫帶草原、亞非荒漠和高寒草甸等多種植被類群，在這種特殊的環(huán)境中禾本科植物分布廣泛，以禾本科植物為建群種或伴生種構(gòu)建了這一地區(qū)具有高寒特征的高寒草原和高寒草甸植物群落［2－4］。據(jù)相關(guān)資料記載，青海高原有禾本科植物55屬246 種31 個(gè)亞種和變種，其中青海特有種10 種2亞種［5－6］。

禾草內(nèi)生真菌(Epichol? sp．)宿主種類豐富，主要分布于溫帶和寒帶地區(qū)，許多冷季型禾草與其共生的內(nèi)生真菌建立了密切的互惠共生關(guān)系［7－9］;在一定程度上，內(nèi)生真菌和宿主禾草之間存在著較為嚴(yán)格的宿主特異性［10－11］。全世界范圍內(nèi)至少有80 個(gè)屬290 多種禾本科植物感染內(nèi)生真菌，其中研究主要集中在多年生黑麥草(Lolium perenne)和高羊茅(Festuca elata)［12－17］。W?li 等［16］研究表明，細(xì)羊茅(F． arundinacea)帶菌率低于20%;Rolston 等［18］對(duì)新西蘭禾草帶菌率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除羊茅屬(Festuca)植物外其他禾草帶菌率較低;Kirkby 等［19］發(fā)現(xiàn)，澳大利亞地區(qū)硬直黑麥草(L． rigidum)內(nèi)生真菌帶菌率隨生境而變化，帶菌率介于4% ～98%;˙Zurek 等［20］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，瑞士境內(nèi)天然草地禾草內(nèi)生真菌帶菌率普遍較高，平均達(dá)70%;Ekanayake 等［21］利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)全世界范圍內(nèi)的高羊茅和草甸羊茅(F． pratensis)帶菌率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，平均帶菌率為33%;Marshall 等［22］對(duì)土耳其境內(nèi)小麥族禾草內(nèi)生真菌進(jìn)行了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小麥族禾草帶菌率高于60%。在國內(nèi)，Wei 等［23］對(duì)中國北方禾草資源帶菌情況開展調(diào)查，結(jié)果表明，大約60%禾草植物感染內(nèi)生真菌;紀(jì)燕玲等［24］檢測(cè)黃山景區(qū)禾草植物感染內(nèi)生真菌的情況發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌帶菌率為39%，其中，拂子茅(Calamagrostis epigeios)帶菌率高達(dá)67%;南志標(biāo)等［25－27］發(fā)現(xiàn)，中國西北部許多禾本科植物也感染內(nèi)生真菌。

雖然，上述研究也涉及部分青海高原地區(qū)禾草資源帶菌率的檢測(cè)，然而青海高原地處北半球寒溫帶，依據(jù)禾草內(nèi)生真菌共生體主要分布在寒帶和溫帶，而赤道和極地尚未發(fā)現(xiàn)禾草內(nèi)生真菌共生體分布的特點(diǎn)［7］，可以推測(cè)青海高原禾草資源感染內(nèi)生真菌潛力較高;同時(shí)當(dāng)?shù)睾滩葙Y源豐富且部分的禾草品種為青藏高原所特有，這就表明青海高原禾草內(nèi)生真菌資源可能存在較大的多樣性和豐富性。然而，迄今為止，針對(duì)青海高原天然草地禾草內(nèi)生真菌資源尚未展開較為系統(tǒng)的調(diào)查和研究。因此，本研究主要對(duì)青海高原禾草內(nèi)生真菌資源進(jìn)行調(diào)查，探尋青海高原地區(qū)禾草內(nèi)生真菌的多樣性，以期為今后高寒地區(qū)禾草內(nèi)生真菌資源深入研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1．1 采樣地點(diǎn)及概況

2007、2009 和2012 年，在青海高原地區(qū)天然草地選取48 個(gè)樣品采集點(diǎn)，于牧草成熟季節(jié)(9 月份)在每個(gè)樣點(diǎn)分別以單株或單叢禾草為單位，采集樣點(diǎn)內(nèi)禾草植物以供后續(xù)的帶菌率檢測(cè)。每個(gè)樣點(diǎn)出現(xiàn)的禾草被認(rèn)為該樣地的禾草樣品，同時(shí)齊地面收獲單株(叢)禾草并按采集點(diǎn)、禾草種名、采集時(shí)間和重復(fù)數(shù)進(jìn)行編號(hào)記錄。其中，每個(gè)單株(叢)間間隔5 ～10 m，共采集20 單株(叢)。并對(duì)各個(gè)采集樣點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)，記錄采集時(shí)間、地理位置、海拔和草地群落類型等信息(表1)。

1．2 內(nèi)生真菌檢測(cè)及分離

禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)采用種子苯胺藍(lán)染色檢測(cè)的方法，具體方法為:在室溫條件下(15 ～22 ℃)將種子置于5%氫氧化鈉溶液過夜，第2 天用蒸餾水沖洗種子數(shù)次以去除種子表面的氫氧化鈉，然后將種子置于有苯胺藍(lán)溶液(配方為0．325 g苯胺藍(lán)溶于100 mL 的蒸餾水，并添加50 mL 乳酸)的培養(yǎng)皿中靜置2 h，鏡檢前將種子外稃去除。將種子放置到載玻片上，用蓋玻片輕按使種子糊粉層和種皮分離，在40倍目鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲。如果種皮或糊粉層中出現(xiàn)大量的深藍(lán)色的菌絲，就認(rèn)為該種禾草感染內(nèi)生真菌，每種禾草種子檢測(cè)量為20 粒［17，23］。挑選單株(叢)帶菌禾草的種子20 粒用70% 酒精消毒1 min，無菌水沖洗兩次，然后用1% 次氯酸鈉消毒3 min，用無菌水沖洗3 次，然后用消毒的濾紙吸干種子表面的無菌水。將消毒后的種子均勻地?cái)[放到裝有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在25 ℃黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 ～4 周，期間每周檢查培養(yǎng)物的生長情況，把出現(xiàn)污染的培養(yǎng)皿及時(shí)清除。當(dāng)內(nèi)生真菌從種子表面出現(xiàn)后，挑取少許菌落進(jìn)行培養(yǎng)。待內(nèi)生真菌產(chǎn)孢后，挑取單個(gè)孢子進(jìn)行純培養(yǎng)，根據(jù)上述培養(yǎng)條件進(jìn)行4 周生長速度測(cè)定，并在第4 周生長速度測(cè)定后選取50 個(gè)孢子測(cè)定孢子形態(tài)、大小及分生孢子梗的長度［23，28－30］。

表1 青海高原禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)樣品采集點(diǎn)信息Table 1 The details of collection sites investigated for detection of endophytes among grasses in Qinghai Plateau

續(xù)表1(1)

續(xù)表1(2)

樣點(diǎn)內(nèi)禾草內(nèi)生真菌感染率按某種禾草帶菌種子占該禾草供試種子百分比計(jì)算，其中不同樣點(diǎn)同一禾草內(nèi)生真菌感染率是所用樣點(diǎn)帶菌率的平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 青海高原內(nèi)生真菌帶菌率

對(duì)青海高原48 個(gè)樣點(diǎn)禾草植物內(nèi)生真菌帶菌率的檢測(cè)結(jié)果表明，披堿草屬(Elymus)、鵝觀草屬(Roeneria)、芨芨草屬(Achnatherum)、艸洽草屬(Koeleria)、冰草屬(Agropyron)、賴草屬(Leymus)、早熟禾屬(Poa)、針茅屬(Stipa)、羊茅屬(Festuca)、拂子茅屬(Calamagrostis)、野青茅屬(Deyeuxia)和狗尾草屬(Setaria)植物均感染內(nèi)生真菌(表2)。其中，披堿草屬(3 種)、針茅屬(4 種)、早熟禾屬(5 種)和羊茅屬(5 種)感染內(nèi)生真菌概率較高。14 種禾本科植物內(nèi)生真菌平均感染率低于50%，而12 種植物內(nèi)生真菌平均感染率大于50%。其中，緣毛鵝觀草(R． pendulina)、紫花針茅(S． purpurea)、醉馬草(A． inebrians)、中華羊茅(F．sinensis)、硬質(zhì)早熟禾(P． sphondylodes)、微藥羊茅(F．nitidula)、毛稃羊茅(F． kirilovii)和紫羊茅(F． rubra)的平均帶菌率均超過80%(表2)。其中，10 個(gè)樣點(diǎn)紫花針茅帶菌率高達(dá)100%。相反，賴草(L． secalinus)、冷地早熟禾(P． crymophila)、長芒草(S． bungeana)、拂子茅(C． epigeios)、青藏野青茅(D． holciformis)、狗尾草(S． viridis)、光葉糙毛草(R． leiophylla)、羊茅(Festuca sp．)內(nèi)生真菌感染率均低于30%。同屬的禾草植物內(nèi)生真菌帶菌率也存在差異，例如:早熟禾屬的硬質(zhì)早熟禾、光稃早熟禾(P． psilolepis)和西藏早熟禾(P． tibetica)帶菌率高于50%，而冷地早熟禾帶菌率只有13%。

表2 青海高原禾草植物內(nèi)生真菌帶菌率檢測(cè)結(jié)果Tables 2 Grass species from Qinghai Plateau that were examined at all sites

表3 青海高原部分禾草內(nèi)生真菌菌落生長速度及分生孢子生長情況Table 3 Colonial growth and length of conidia of endophyte isolates obtained from four grass species of collection site in Qinghai Plateau

2．2 青海高原禾草內(nèi)生真菌菌落生長特性

26 種感染內(nèi)生真菌的禾草植物中，只有紫花針茅、麥賓草、光稃早熟禾和異針茅4 個(gè)物種中成功分離得到內(nèi)生真菌(表3)。其中，光稃早熟禾菌落生長速度最快(10．8 mm·周－1)，而麥賓草菌落生長速度最慢(3．8 mm·周－1)。紫花針茅菌落正面邊緣形成明顯的棕色暈圈(圖1A)，而其他內(nèi)生真菌菌落邊緣未發(fā)現(xiàn)暈圈。同時(shí)，分離的內(nèi)生真菌菌落反面質(zhì)地顏色也存在差異，例如:麥賓草和紫花針茅菌落反面顏色較暗(圖1 B、E)，主要以褐色和棕色為主;而異針茅和光稃早熟禾菌落反面顏色較淺，以黃色為主(圖1 H、K)。麥賓草分生孢子長度明顯低于異針茅和紫花針茅，與光稃早熟禾分生孢子長度相近。異針茅分生孢子梗長度明顯長于其他3 種，光稃早熟禾和麥賓草分生孢子梗長度相近。而紫花針茅分生孢子?；繉挾让黠@小于其他3 種禾草內(nèi)生真菌的分生孢子?；鶎??？梢?，分離的內(nèi)生真菌具備生長速度較慢、菌落正面白色、分生孢子著生在分生孢子梗頂端等特性，符合Epichlo? 屬內(nèi)生真菌菌落的基本特征，確定分離所得4種內(nèi)生真菌為Epichlo? 屬內(nèi)生真菌。

3 討論

青海高原地處青藏高原東北部，由于海拔高、晝夜溫差大和植物生長期較短等特征，導(dǎo)致該地域禾草植物的生長和分布出現(xiàn)特異性［6，31－32］;本研究首次較為系統(tǒng)地對(duì)青海高原地區(qū)禾草植物感染內(nèi)生真菌情況開展調(diào)查，結(jié)果表明，青海高原禾草感染內(nèi)生真菌率較高，同時(shí)各物種間也存在差異，其中醉馬草和紫花針茅帶菌率在各樣點(diǎn)均較高(表2)。根據(jù)協(xié)同進(jìn)化地理鑲嵌假說，自然選擇對(duì)不同物種群落的作用效應(yīng)存在差異?；蛄鳌⒒蚱?、基因缺失或出現(xiàn)等因素共同作用，形成了同一物種的不同種群在地球板塊間呈現(xiàn)鑲嵌分布的現(xiàn)象［33］。內(nèi)生真菌與其宿主禾草相互作用，導(dǎo)致不同基因型的禾草－內(nèi)生真菌共生體在不同空間范圍內(nèi)存在較大差異［34］。因此，在不同的環(huán)境條件下，垂直傳播的禾草內(nèi)生真菌感染同一宿主的能力在不同地理區(qū)域存在明顯的差異。例 如， 在 發(fā) 達(dá) 的 無 性 分 蘗 和 強(qiáng) 大 的種子生產(chǎn)能力的共同作用下，群落中處于優(yōu)勢(shì)地位的多年生禾草可在穩(wěn)定的生境條件下獲得較高的帶菌率［34］。相反，如果內(nèi)生真菌和宿主間介于中性或者敵對(duì)關(guān)系時(shí)，群落中禾草資源的帶菌率往往較低或者不帶菌。本研究中帶菌率較高的醉馬草通過與其侵染的內(nèi)生真菌相互作用產(chǎn)生次生代謝物(麥角堿)使草食家畜和昆蟲產(chǎn)生拒食性;同時(shí)醉馬草種子產(chǎn)量較高，平均單株種子量就超過800 粒，從而有效提高整個(gè)種群的帶菌率［35－39］，這與國外黑麥草和高羊茅種群具有較高帶菌率的研究結(jié)果相似［7，9，15，40－41］。同時(shí)，本研究中帶菌率最高的紫花針茅作為青藏高原特有的禾本科植物，在高寒草地中形成了以紫花針茅為單一優(yōu)勢(shì)種的植物群落［42－44］，紫花針茅具有較強(qiáng)的分蘗和種子生產(chǎn)能力，同時(shí)在牧草種子成熟期，種子形成的芒針能對(duì)家畜體表造成傷害，降低家畜在種子形成期對(duì)紫花針茅采食，從而使其種群不斷更新和擴(kuò)大［45－47］。

圖1 青海高原部分禾草內(nèi)生真菌PDA 菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子結(jié)構(gòu)Fig．1 Photographs of Qinghai Plateau endophyte cultures showing colony and conidial morphologies

另外，禾草內(nèi)生真菌帶菌率受到種子傳播能力和環(huán)境溫度的嚴(yán)格控制。例如，紫花針茅種子成熟期，芒兩側(cè)密被羽狀毛極易粘附到家畜體表，從而不斷擴(kuò)大帶菌種群分布面積。本研究樣點(diǎn)主要分布在北半球高寒地帶，海拔介于3 007 ～4 304 m(表1)，在海拔最高點(diǎn)只有毛稃羊茅帶菌，隨著海拔降低，溫度逐漸升高，帶菌植物種類也明顯增加，這種現(xiàn)象在其他植物中也得出相似的結(jié)果。如，巴拿馬地區(qū)熱帶森林中樹葉單位面積上內(nèi)生真菌的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于北極周圍生長樹木葉片內(nèi)生真菌的多樣性［48］。

在本次調(diào)查中，雖發(fā)現(xiàn)有48 種禾本科植物感染內(nèi)生真菌，但其中能純培養(yǎng)分離得到內(nèi)生真菌的禾本科植物只有4 種(表3，圖1)，表明內(nèi)生真菌分離率較低。這可能由以下原因造成:一方面植物或種子材料存放時(shí)間較長，造成內(nèi)生真菌活力喪失［23，49］;另一方面不同植物感染的內(nèi)生真菌分離條件和培養(yǎng)基質(zhì)存在差異［50－51］。Li 等［50］研究表明，醉馬草內(nèi)生真菌在不同培養(yǎng)條件(溫度、pH 值)、營養(yǎng)配比和培養(yǎng)基上生長情況存在差異。本研究中，只采用PDA 培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)條件，可能是造成禾草內(nèi)生真菌分離率較低的主要原因，所以，在今后開展的研究中嘗試使用不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)及營養(yǎng)條件來探索適合不同內(nèi)生真菌分離的最佳條件，為進(jìn)一步開展禾草內(nèi)生真菌分類學(xué)鑒定提供保障。

綜上所述，青海高原感染禾草內(nèi)生真菌宿主較為豐富，調(diào)查草地的主要建群種和特有種，如:針茅屬、芨芨草屬、早熟禾屬和羊茅屬等禾草均不同程度地被禾草內(nèi)生真菌侵染，其中紫花針茅和醉馬草帶菌率最高;然而內(nèi)生真菌分離率較低，同時(shí)，分離得到的內(nèi)生真菌之間存在形態(tài)上的差異，這可能與其感染內(nèi)生真菌種類不同有關(guān)。由于本研究只涵蓋青海高原的部分地區(qū)，后續(xù)的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，從而總結(jié)禾草內(nèi)生真菌共生體在高原地區(qū)分布特點(diǎn);另外，需對(duì)分離內(nèi)生真菌，尤其是高寒草地建群種——紫花針茅開展分子標(biāo)記試驗(yàn)，確定其感染內(nèi)生真菌的分類地位，并對(duì)內(nèi)生真菌的宿主特異性進(jìn)行研究，為今后利用禾草內(nèi)生真菌作為育種材料提供基礎(chǔ)資料。

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