余 婧，趙杰宏，鄒 頡，付 強，張孝廉

（1．貴州省煙草科學研究院，煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點實驗室，貴州 貴陽550081；

2．貴州煙葉復烤有限責任公司銅仁復烤廠，貴州 銅仁554300）

煙草及煙草制品的出口創(chuàng)匯是國際貿(mào)易的重要壁壘，因此，建立高效、快速、準確的烤后煙葉轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)至關(guān)重要，而基于DNA 檢測的PCR技術(shù)中，獲取高質(zhì)量的DNA 模板是轉(zhuǎn)基因檢測的前提［1］。在GB／T 24310－2009《煙草及煙草制品轉(zhuǎn)基因檢測方法》中［2］，烤后煙葉DNA 的提取方法為CTAB法，操作人員需要接觸氯仿等有毒試劑，且該方法為手工提取，耗時較長。目前，自動化DNA 提取技術(shù)在醫(yī)學中得到廣泛應用，已有關(guān)于人的骨骼、血液、毛發(fā)等特殊樣本的DNA 自動化提取方法［3－7］，但該技術(shù)應用于植物DNA 的提取鮮見報道。磁珠法DNA 提取方法是利用細胞裂解液裂解細胞，從細胞中游離出來的DNA 分子被吸附到磁性顆粒表面，蛋白質(zhì)等分子不被吸附而留在溶液中，在磁場作用下，磁性顆粒與液體分開，回收顆粒，再用純水或TE 洗脫吸附的DNA［8］。該方法無需使用氯仿、異戊醇等有機溶劑，可整合自動化工作站批量提取生物DNA。因此，筆者采用BioMek NXP自動化工作站（96通道）與國產(chǎn)磁珠法植物DNA 提取試劑盒相結(jié)合，建立了自動化批量提取烤后煙葉DNA（作為PCR 模板）的方法，以獲取高質(zhì)量的烤后煙葉DNA 滿足PCR 檢測的需求。

1 材料與方法

1．1 煙葉、試劑與儀器

煙葉：取烤后煙葉300g左右（混合樣），報紙包好置于烘箱50℃過夜烘干，用粉碎機研磨成細粉后直接用于DNA 提取。

試劑：磁珠法植物DNA 提取試劑盒（長春市志昂生物科技有限公司產(chǎn)品），內(nèi)含磁珠原液、裂解液、提取液、洗滌液，洗滌液按說明書要求加入異丙醇，80% 乙 醇 及 無 水 乙 醇 自 備；rTaq 酶（貨 號DR100A）、DNA Marker、6×Loading buffer均為大連寶生物公司產(chǎn)品。

儀器：BioMek NXP自動化工作站（美國BECKMAN 公司），含96 通道機械臂、磁力架、振蕩加熱模塊，機械臂可實現(xiàn)樣品及槍頭盒在各工作模塊的轉(zhuǎn)移、加樣、洗脫等操作；NanoDrop2000 超微量分光光度計（美國Thermo公司）；C1000Touch PCR儀（美國BIO－RAD公司）；ChemiDocXRS 凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO－RAD 公司）；Centrifuge 5471R 離心機（德國eppendorf公司）；國產(chǎn)恒溫水浴鍋。

1．2 BioMek NXP耗材配置及程序

參照磁珠法植物DNA 提取試劑盒操作流程略作修改，在BioMek NXP自動化工作站上進行耗材的配置及軟件程序的編寫。

1．3 材料預處理

取70～100mg煙葉粉末，加入450μL裂解液，65℃水浴10min或30min，加入150μL提取液，室溫放置5min，12 000r／min離心10min，取80μL上清液至96孔深孔板。磁珠原液在使用前按1∶10（V／V）加入無水乙醇制成磁珠混合液，洗滌液在使用前按3∶2（V／V）比例加入異丙醇。

1．4 DNA 提取

將96孔深孔板置于工作站模塊臺面上，點擊操作軟件，按以下程序運行：加入100μL磁珠混合液；27℃振蕩60s，靜置3min，27℃再次振蕩60s，靜置1min；吸磁2 min，棄廢液；加入150μL 洗滌液，27℃振蕩90s；吸磁60s，棄廢液；加入80%乙醇380μL，27℃振蕩90s，吸磁60s，棄廢液，該步驟重復2～4次；56℃干燥15min；加入60μL 滅菌雙蒸水，65℃振蕩20s，室溫放置5min，吸磁2 min；吸出50μL DNA溶液至96孔PCR 板中備用。

1．5 DNA 質(zhì)量評價

1．5．1 紫外吸收法 取1μL 烤后煙葉DNA 溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA純度及濃度。根據(jù)國家標準GB／T 24310－2009《煙草及煙草制品 轉(zhuǎn)基因檢測方法》規(guī)定，DNA 提取物濃度≥100ng／μL，DNA 提取物純度在1．7≤OD260／OD280≤1．9，計算DNA 提取合格率。

1．5．2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 取DNA 合格率最高的處理，且在OD260nm 處有明顯吸收峰的煙葉DNA 溶液5μL，1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為恒壓100V、緩沖液為1×TAE，通過凝膠成像系統(tǒng)對基因組DNA 質(zhì)量進行觀察拍照。

1．6 定性PCR 擴增的適應性檢測

為驗證上述方法提取的DNA 是否適用于普通PCR 擴增，取DNA 溶液稀釋至100ng／μL為模板，對煙草內(nèi)源硝酸還原酶基因（NR）進行定性PCR 擴增。根據(jù)國家標準GB／T 24310－2009《煙草及煙草制品 轉(zhuǎn)基因檢測方法》中NR 引物檢索基因原序列，設(shè)計并合成NR 基因特異性引物（5’－CCGGAGGCGGTGGTTCAAAGTA－3’，5’－AAGTTCAGCATCAACATGGGGAGG－3’；擴增片段266bp）。PCR反應體系20μL：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 1μL，rTaq 0．2μL（5 U／μL），DNA 1μL（100ng／μL），引物各1μL（10μmol／L）。PCR 反應條件：95℃預變性5min；94℃30s，65℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。反應結(jié)束后加入6×Loading buffer 5μL，混勻后取8μL 于凝膠成像系統(tǒng)中檢測。

2 結(jié)果與分析

2．1 煙葉DNA 溶液的濃度及純度

從表可知，處理1 收集到的DNA 溶液純度差且呈淡黃色渾濁狀，可能是由于樣本量較大，裂解不充分，且水浴時間過長，煙葉中的酚類物質(zhì)容易氧化而發(fā)生褐化，在后期2次80%乙醇洗滌中不能完全洗去雜質(zhì)。處理4 提取的DNA 濃度較為理想，平均值為153．3ng／μL，且純度在OD260／OD280的平均值為1．81，標準偏差（SD）為0．06，樣本總合格率達95．8%，且最后收集到的DNA 溶液基本無色素污染。表明，處理4 提取的DNA 效果較其他3 種處理好。

表 不同處理自動化提取煙葉DNA的濃度及純度Table Comparison of the concentration and purity of automatic extracted DNA by different treat

圖1 處理4自動化提取烤后煙葉的DNA波長掃描Fig．1 Wavelength of the flue－cured tobacco DNA extracted by automation workstation

對處理4提取的DNA 進行檢測，在260nm 處有明顯的吸收峰（圖1），說明提取的DNA 雜質(zhì)（多糖及其他代謝產(chǎn)物）含量少，純度較高。

2．2 提取煙葉DNA溶液質(zhì)量

從圖2看出，DNA 條帶呈彌散、拖尾狀，這是由于煙葉在調(diào)制過程中經(jīng)過高溫（68℃左右）處理后基因 組DNA 降 解 嚴 重［9－10］導 致。但DNA 主 帶 清 晰，且DNA 純度穩(wěn)定性較好，符合PCR 檢測需要。

圖2 處理4提取烤后煙葉DNA凝膠電泳圖譜Fig．2 Gel electrophoresis of the flue－cured tobacco DNAextracted by automation workstation

圖3 自動化提取烤后煙葉DNA NR 基因PCR 擴增圖譜Fig．3 PCR amplification result of NR－gene

2．3 定性PCR 的適應性檢測

從圖3 看出，提取煙葉DNA 模板均能擴增出266bp左右的特異性條帶，表明，DNA 溶液中無酚類、多糖等次生物質(zhì)抑制Taq酶活性，且在自動化提取過程中，樣品經(jīng)80%乙醇洗滌后在加熱振蕩器上56℃干燥15 min能有效去除殘留乙醇。表明，處理4提取的DNA 符合PCR 定性擴增檢測要求。

3 結(jié)論與討論

通過磁珠法結(jié)合自動化工作站提取烤后煙葉DNA，處理4 提取的純度及濃度的總合格率為95．8%，且樣品中無酚類、多糖、乙醇等影響Taq酶活性的殘留物質(zhì)，DNA 可直用于PCR 反應。自動化工作站硬件及軟件程序適配后，操作人員只需負責預處理、加樣及上機，系統(tǒng)即可根據(jù)軟件設(shè)計程序，自動化提取DNA。其中，樣本初始量及80%乙醇洗滌次數(shù)是DNA 提取的關(guān)鍵，樣本量過大則裂解不充分且離心不完全，所取上清液中仍有渾濁的粉末殘留，80%乙醇多次洗滌也很難獲得高質(zhì)量的DNA，而在控制好初始樣本量的情況下（一般為70mg），80%乙醇4次洗滌能進一步純化DNA，不會對DNA 濃度造成損失。

烤后煙葉DNA 提取的經(jīng)典方法，即CTAB 法在提取過程中為人工提取，當樣本量較多時需耗費較大的人力，且樣品交叉污染可能性增大。本研究建立的自動化提取方法，相對于人工提取而言，樣本量越大提取優(yōu)勢越明顯，以96份樣品的提取工作為例，樣本經(jīng)裂解、水浴、離心后取上清液至96孔深孔板，上樣后系統(tǒng)運行約110min便可完成96份樣的提取工作；而CTAB法提取烤后煙葉DNA，每個操作人員工作8h最多只能提取48份樣品。

目前，基于DNA 提取的PCR 檢測技術(shù)已在分子標記輔助育種、親緣關(guān)系分析、基因定位及種子純度鑒定等基礎(chǔ)研究及應用領(lǐng)域得到廣泛應用，而大規(guī)模的PCR 檢測中，DNA 模板的制備是進行大批量分子檢測的基礎(chǔ)［11］。本研究所建立的提取方法同樣適于玉米、水稻等其他作物的高通量DNA 提取工作，但根據(jù)植物材料DNA 提取特性的不同，需對前處理進行優(yōu)化及自動化工作站軟硬件的適配，以提取到適于PCR 檢測的DNA 模板。

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