占劍峰，胡孝明，王蔚新，吳 鵬

（1.黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

磷脂酶是一類可以將非水化磷脂水解成為脂肪酸和水化磷脂的酶類，在植物油脫膠以及乳制品加工業(yè)、焙烤食品工業(yè)、蛋黃醬加工業(yè)等領(lǐng)域具有重要用途。酶法脫膠是一種經(jīng)濟(jì)節(jié)約、高效穩(wěn)定、綠色環(huán)保的毛油脫膠方法[1-2]。目前，毛油脫膠所用的磷脂酶主要通過(guò)微生物發(fā)酵得到，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)研究。KIM M[3]等以木糖、磷酸氫銨和硫酸銨為最佳復(fù)合碳氮源，發(fā)酵得到磷脂酶酶活力為18 U/mL；SIMKHADA J R等[4]以葡萄糖2%、酵母膏1.5%、蛋白胨0.5%為碳氮源得到磷脂酶活力為4.5 U/mL；付建紅等[5]在接種量為2%，裝液量為50 mL/250 mL，25 ℃條件下培養(yǎng)36 h，磷脂酶活力達(dá)到17.5 U/mL；王金梅等[6]以葡萄糖1.0%、牛肉膏0.75%、蛋白胨0.75%分別為碳氮源，發(fā)酵72 h得到磷脂酶活力為44 U/mL；司武陽(yáng)等[7]以氯化銨、麥芽糖和卵磷脂為復(fù)合碳氮源得到磷脂酶活力為18.68 U/mL。

微生物發(fā)酵是一個(gè)受多種因素影響的過(guò)程，發(fā)酵產(chǎn)物決定于微生物的性能和培養(yǎng)環(huán)境，如培養(yǎng)基的組成配比、微生物的種齡和發(fā)酵條件等[8-10]。因此，如何充分發(fā)揮微生物的生長(zhǎng)能力，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶的高產(chǎn)，需要從培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[11-13]。

本研究以磷脂酶活力和生物量為參考指標(biāo)，首先在搖瓶水平對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AF-1的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步采用15 L發(fā)酵罐考察發(fā)酵溫度、時(shí)間和通氣量對(duì)產(chǎn)磷脂酶的影響，為磷脂酶的擴(kuò)大培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AF-1：實(shí)驗(yàn)室篩選，固體斜面4 ℃保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，

pH 7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，磷酸氫二鈉15 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.1 g/L，pH 7.2。

1.1.3 化學(xué)試劑

瓊脂：天津市福晨化學(xué)試劑廠；麥芽糖、蔗糖（分析純）、淀粉（分析純）、磷酸氫二銨（分析純）：上海滬試化工有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大豆磷脂粉末：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9003電熱恒溫培養(yǎng)箱：中新醫(yī)療儀器有限公司；752紫外光分光光度計(jì)：南京麒麟分析儀器有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠；Biotch-8000全自動(dòng)控制發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；T50自動(dòng)滴定儀：梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子活化：三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基，從斜面上取2環(huán)接入培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法：三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液接入培養(yǎng)。

15 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：裝液系數(shù)（裝液體積/發(fā)酵罐體積）為0.67，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液以10%體積分?jǐn)?shù)的接種量接入發(fā)酵罐。

1.3.2 培養(yǎng)基組成的確定

發(fā)酵培養(yǎng)基組成中，依次改變培養(yǎng)基中碳源、氮源的種類，確定碳源和氮源的濃度和比例，無(wú)機(jī)鹽的濃度和比例，將發(fā)酵液離心取上清液，測(cè)定不同組成對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AF-1發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶活力的影響。

1.3.3 培養(yǎng)條件的確定

分別改變發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量（1%、5%、10%、15%、20%）、裝液量（25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、發(fā)酵溫度（20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h），發(fā)酵后測(cè)定其生物量和酶活力以確定最佳培養(yǎng)條件。

1.3.4 發(fā)酵罐（15 L）擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化

擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)的溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃）、發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值（7.0、7.5）和通氣量（0.2 m3/h、0.3 m3/h、0.4 m3/h），測(cè)定其生物量和酶活力以確定最佳擴(kuò)大培養(yǎng)條件。

1.3.5 磷脂酶活力及生物量的測(cè)定方法

[14]方法，測(cè)定磷脂酶活力。酶活力單位定義為：在特定條件下1 min水解磷脂產(chǎn)生1 μmol 量游離脂肪酸所需的酶量即為一個(gè)磷脂酶活力單位（U/mL）。

采用比濁法[15]測(cè)定生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AF-1的生長(zhǎng)曲線

250 mL三角瓶中裝30 mL種子培養(yǎng)液，從斜面上取2環(huán)菌體接入，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，每隔2 h取一次樣，波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定Bacillus cereusAF-1的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Bacillus cereus AF-1生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus cereus AF-1

由圖1可知，種子液的生長(zhǎng)情況為：0～2 h為延遲期、2～14 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，20 h后進(jìn)入衰老期。幼齡和老齡菌種適應(yīng)性差，延滯期長(zhǎng)，不利于菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，因此選擇在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的12 h的種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源

培養(yǎng)基中分別加入15 g/L葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖4種碳源。裝液量為50 mL/250 mL，將培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入，搖床溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，測(cè)定發(fā)酵液酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同碳源對(duì)磷脂酶活力的影響Fig.2 Effect of different carbon source on enzyme activities

碳源是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或?yàn)闄C(jī)體提供所需要的能量，是影響菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素。由圖2可知，當(dāng)葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖作為不同碳源時(shí)，在一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液酶活力明顯高于其他碳源。綜合考慮磷脂酶活力和發(fā)酵時(shí)間，選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2.2 氮源

培養(yǎng)基中分別加入15 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、（NH4）2HPO4、NH4Cl 5種氮源。裝液量為50 mL/250 mL，將培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入，搖床溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，測(cè)定發(fā)酵液酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同氮源對(duì)磷脂酶活力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on enzyme activities

氮源構(gòu)成微生物細(xì)胞和含氮的代謝產(chǎn)物，對(duì)于獲得代謝產(chǎn)物具有重要影響。由圖3可知，無(wú)機(jī)氮源得到的發(fā)酵液酶活力都遠(yuǎn)低于有機(jī)氮源，蛋白胨作為氮源時(shí)，發(fā)酵液的酶活力高于其他有機(jī)氮源，因此，選擇蛋白胨作為氮源。

2.2.3 葡萄糖和蛋白胨的添加量

碳氮比對(duì)于發(fā)酵過(guò)程有著較大的影響。例如碳源過(guò)多，會(huì)形成較低的pH值；碳源不足，則易引起菌體衰老和自溶；氮源過(guò)多，易形成較高的pH值；氮源不足，菌體繁殖量少而影響產(chǎn)量。以葡萄糖和蛋白胨分別作為碳、氮源，添加量分別設(shè)置為1%、2%、3%、4%進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件同上，考察葡萄糖和蛋白胨添加量對(duì)磷脂酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 葡萄糖和蛋白胨添加量對(duì)磷脂酶活力的影響Table 1 Effect of glucose and peptone concentration on enzyme activities U/mL

由表1可知，當(dāng)葡萄糖和蛋白胨添加量低時(shí)，由于碳源和氮源不足，造成菌體衰老和自溶，菌體量減少導(dǎo)致酶活力低；添加量高時(shí)，菌體量增加，造成酶活力偏低。葡萄糖2%，蛋白胨3%時(shí)磷脂酶活力最大。因此，選擇葡萄糖和蛋白胨添加量分別為2%和3%。

2.2.4 無(wú)機(jī)鹽的種類及添加量

以磷脂酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取因素磷酸氫二鈉（A）、磷酸二氫鉀（B）、硫酸鎂（C）、氯化鈣（D）4種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 無(wú)機(jī)鹽添加量?jī)?yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for inorganic salt addition optimization

由表2可知，對(duì)磷脂酶活力影響的無(wú)機(jī)鹽由大到小的順序?yàn)榱姿釟涠c（A）＞磷酸二氫鉀（B）＞硫酸鎂（C）＞氯化鈣（D）。無(wú)機(jī)鹽的最佳組成為A2B2C3D2，即磷酸氫二鈉1.5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.06%，氯化鈣0.01%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，磷酸氫二鈉添加量對(duì)磷脂酶活力影響顯著，與極差分析結(jié)果一致。其他因素均無(wú)顯著影響。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 接種量

由圖4可知，當(dāng)接種量過(guò)小時(shí)，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，不利于高產(chǎn)酶；而接種量＞10%時(shí)，微生物增長(zhǎng)過(guò)快并產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，使菌種老化，也不利于酶的合成，故選擇10%為最佳接種量。

圖4 接種量對(duì)菌種生長(zhǎng)和磷脂酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculum on bacteria growth and phospholipase production

2.3.2 裝液量

圖5 裝液量對(duì)菌種生長(zhǎng)和磷脂酶產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of loading volume on bacteria growth and phospholipase production

由圖5可知，生物量與裝液量成反比，裝液量較多時(shí)，會(huì)影響發(fā)酵液的溶氧，說(shuō)明這種菌種是好氧菌；但產(chǎn)酶量在50 mL/250 mL時(shí)達(dá)到最大值，綜合考慮，選擇50 mL/250 mL為最佳裝液量。

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH 值

圖6 起始pH值對(duì)菌種生長(zhǎng)和磷脂酶產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of initial pH on bacteria growth and phospholipase production

由圖6可知，當(dāng)初始pH值為7.0時(shí)，生物量最大（OD600nm0.95）和發(fā)酵液的酶活力最高（22.98 U/mL），表明pH值7.0為該菌發(fā)酵合適的初始培養(yǎng)基pH值。微生物需要在一定的pH值環(huán)境中方能正常生長(zhǎng)繁殖，如果pH值不適，不但會(huì)妨礙微生物菌體的正常生長(zhǎng)，而且還會(huì)改變微生物的代謝途徑和代謝產(chǎn)物的性質(zhì)。

2.3.4 發(fā)酵溫度

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)和磷脂酶產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on bacteria growth and phospholipase production

由圖7可知，35 ℃時(shí)菌體生物量最大（OD600nm1.15）和發(fā)酵液酶活力最大（26.13 U/mL），說(shuō)明該溫度下適合菌體的生長(zhǎng)和磷脂酶合成的積累。溫度的變化對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酶反應(yīng)的速率、蛋白質(zhì)的性質(zhì)和發(fā)酵液的物理性質(zhì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)特性和產(chǎn)物的合成。

2.3.5 發(fā)酵時(shí)間

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種生長(zhǎng)和磷脂酶產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on bacteria growth and phospholipase production

由圖8可知，30 h后酶活力達(dá)到最大值25.82 U/mL，36 h后菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大值OD600nm1.14，綜合考慮，培養(yǎng)時(shí)間為30 h。發(fā)酵時(shí)間短，菌體生長(zhǎng)不足導(dǎo)致生成的酶活力低，但是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，組成成分也發(fā)生改變，菌體釋放體內(nèi)的分解酶及各種環(huán)境因子的改變抑制了酶的活性。

2.4 發(fā)酵罐（15 L）擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在15 L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，6 h取一次樣，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溫度、pH值和通氣量的情況進(jìn)行控制和分析，結(jié)果見(jiàn)圖9～圖11。

圖9 不同發(fā)酵溫度對(duì)生物量(A)及磷脂酶產(chǎn)量(B)的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

圖10 起始p H值對(duì)生物量(A)及磷脂酶產(chǎn)量(B)的影響Fig.10 Effect of initial pH on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

圖11 空氣流量對(duì)生物量(A)及磷脂酶產(chǎn)量(B)的影響Fig.11 Effect of airflow rate on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

由圖9可知，溫度較低時(shí)不利于菌體的生長(zhǎng)和磷脂酶的生成，而高溫僅在開始18 h內(nèi)有利于磷脂酶的合成和菌體的生長(zhǎng)，因此，利用開始階段促進(jìn)生物量的積累，然后有利于磷脂酶的合成，所以磷脂酶合成的適宜發(fā)酵溫度為35 ℃。

由圖10可知，發(fā)酵液的pH值由7.0提高到7.5時(shí)，生物量和酶活力均提高，只是生物量在24 h達(dá)到最大值OD600nm1.15，而酶活力在30 h達(dá)到最大值39.88 U/mL，可見(jiàn)弱堿性條件適合Bacillus cereusAF-1的細(xì)胞生長(zhǎng)。

由搖瓶擴(kuò)大到15 L發(fā)酵罐后，最適pH值由7.0提高到7.5，可能由于前期發(fā)酵消耗了一定的碳源，產(chǎn)生的二氧化碳使得pH值下降，這種情況在加氧發(fā)酵時(shí)效果更加明顯，所以當(dāng)pH值為弱堿性時(shí)，正好抵消了這種影響。

由圖11可知，在開始階段通氣量增加有利于菌體的生長(zhǎng)和酶的生成，但是隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，通氣量為0.3 m3/h的發(fā)酵液在24 h和30 h分別得到了最大生物量OD600nm1.18和酶活力41.57 U/mL，表明通氣量過(guò)高導(dǎo)致菌體前期生長(zhǎng)旺盛，導(dǎo)致了碳源不足和菌體的衰老，結(jié)合發(fā)酵罐中產(chǎn)生的氣泡情況，通氣量為0.3 m3/h有利于酶的合成與積累。

3 結(jié)論

以蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）AF-1發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶，最佳培養(yǎng)基為葡萄糖2%，蛋白胨3%，磷酸氫二鈉1.5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.06%，氯化鈣0.01%。在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶，最佳條件為發(fā)酵時(shí)間30 h，發(fā)酵溫度35 ℃，初始pH值7.0，裝液量50 mL/250 mL，接種量10%。

在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)磷脂酶，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基pH值為7.5，裝液系數(shù)為0.67，接種量10%，發(fā)酵溫度35 ℃，通氣量0.3 m3/h，得到的粗酶液酶活為41.57 U/mL。

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