賓彬，陸海旺，王杰，王德勝，徐杰新，覃智標(biāo)，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530023)

強(qiáng)精煎對少弱精子癥大鼠精子腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶基因表達(dá)的影響?

賓彬，陸海旺△，王杰，王德勝，徐杰新，覃智標(biāo)，梁勁松，龐秋華，崔錦珠

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530023)

目的:探討健脾益腎中藥強(qiáng)精煎對少弱精子癥模型大鼠附睪精子腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)基因表達(dá)影響。方法:80只成年SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，正常組大鼠每天給予生理鹽水，模型組給予奧硝唑(ornidazde，ORN)800 mg/(kg·d)，黃精贊育膠囊組給予［ORN800 mg/(kg·d)+黃精贊育膠囊400 mg/(kg·d)］，強(qiáng)精煎組大鼠每天給予［ORN800 mg/ (kg·d)+強(qiáng)精煎10 g/(kg·d)］，4周后取各組大鼠附睪組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行AC、PDE基因表達(dá)的測定。結(jié)果:強(qiáng)精煎組大鼠PDE基因表達(dá)水平顯著低于模型組，而AC基因表達(dá)水平顯著高于模型組。結(jié)論:強(qiáng)精煎中藥可明顯下調(diào)少弱精子癥模型大鼠附睪精子PDE基因表達(dá)水平并顯著上調(diào)其AC基因的表達(dá)水平，可能是其治療少弱精子癥的機(jī)制之一。

強(qiáng)精煎;腺苷酸環(huán)化酶;磷酸二酯酶;少弱精子癥

少弱精子癥是男性不育的常見原因，其中弱精子癥占男性不育患者的很大部分［1］。因此，精子運(yùn)動(dòng)障礙和精子活動(dòng)力低下的分子機(jī)制一直是男性生殖研究的熱點(diǎn)。研究顯示［2］，與活動(dòng)力正常的精子比較，在精子活力低下患者中，精子可溶性腺苷酸環(huán)化酶(soluble adenylylcyclase，sAC))的表達(dá)減少和磷酸二酯酶PDE4C的表達(dá)增加。另外有報(bào)道，可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)基因敲除的雄性小鼠均出現(xiàn)精子運(yùn)動(dòng)障礙和不育［3］。健脾益腎中藥強(qiáng)精煎是筆者臨床治療少弱精子癥的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究表明，該復(fù)方可顯著改善少弱精子癥患者的精子密度和活力［4］。本研究通過建立少弱精子癥模型大鼠，探討強(qiáng)精煎對少弱精子癥大鼠附睪腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶基因表達(dá)影響，以揭示其治療少弱精子癥的部分可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級成年雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(280± 10)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK桂～0004)。

1.2 藥物

中藥強(qiáng)精煎由菟絲子、枸杞子、當(dāng)歸、黃芪、黨參、續(xù)斷、益母草、神曲等組成［4］，采用單味中藥配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn));黃精贊育膠囊由何首烏、黃精、菟絲子、枸杞子、五味子、熟地黃等組成(上海新亞藥業(yè)邗江有限公司生產(chǎn));奧硝唑膠囊(ORN，四川百利藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.3 主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒Real Master Mix SYBR Green(天根生化科技(北京)有限公司); Trizol(天根生化科技(北京)有限公司);TaKaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司);裂解液RZ(天根生化科技(北京)有限公司);AC、PDE、β-actin引物(天根生化科技(北京)有限公司);UV-240紫外-可見光分光光度計(jì)(北京譜朋科技有限公司);PCR擴(kuò)增儀(Eppendorfmastereyelergadient，德國);DNA Engine OpticonTM 2 CFD-3220型連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)(美國MJ Research公司)。

1.4 動(dòng)物分組與處理

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組。造模方法參考熊芬法［5］:正常組大鼠每天給予生理鹽水，模型組給予ORN800 mg/(kg·d)，黃精贊育膠囊組(陽性對照)給予［ORN800 mg/(kg·d)+黃精贊育膠囊400 mg/(kg·d)］，強(qiáng)精煎組大鼠給予［ORN800 mg/(kg·d)+強(qiáng)精煎配方顆粒10 g/(kg· d)］。試驗(yàn)藥物均以生理鹽水新鮮配制成混懸液，每天每只大鼠灌以4 ml各組溶液，每日1次，連續(xù)4周。大鼠每周稱重1次以調(diào)整給藥劑量。

1.5 標(biāo)本采集與處理

末次給藥24 h后，各組大鼠分批以10%烏拉坦麻醉，取睪丸附睪組織約100 mg，剪碎后加入1 mLTrizol試劑于-80℃冰箱保存，以備總RNA的提取。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量測定

按Trizol說明書方法提取附睪組織的總RNA，紫外-可見光分光光度計(jì)測定OD值分析提取RNA的純度和濃度，確保OD值在1.8～2.0之間，置于-80℃冰箱保存;逆轉(zhuǎn)錄(10 μl體系):5× PrimeScript Buffer 2 μl，Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μl，dNTP mixture(10 μM each)0.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)2 μL，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)RNA濃度(ng/μl)，參考Takara試劑盒說明書，所加入RNA最大量為500 ng，計(jì)算所加體積(μl)，以RNase ddH2O補(bǔ)至5 μl，反應(yīng)條件:37℃15 min，85℃5 s;實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):反應(yīng)體系20 μl，引物序列:PDE(71 bp)。上游引物:5’ACA GGGGCTTCAGTAACAGC3’，下游引物:5’GGTGG AGGTGGAGTACAA CG3’;AC(159 bp)，上游引物: 5’GCAAGGACACCTCTCCGTC3’，下游引物:5’AGAGTCCAGAGTCCCAGGTC3’;β-action(150bP)，上游引物:5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游引物:5’TTTAATGTCACGCACGATTTC3’。擴(kuò)增條件:①94℃15 min，94℃10 s，55℃20 s，72℃20 s，45個(gè)循環(huán);②72℃5 min。擴(kuò)增后根據(jù)Ct值計(jì)算各基因的相對表達(dá)量，每個(gè)樣本檢測重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以β-action為內(nèi)參照基因，各待測基因的Ct值均用其對應(yīng)β-action基因的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用PEMS 3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1圖1顯示，強(qiáng)精煎組可以明顯下調(diào)PDE基因表達(dá)水平，上調(diào)AC基因表達(dá)水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠附睪AC、PDEmRNA相對表達(dá)量比較(±s)

表1 各組大鼠附睪AC、PDEmRNA相對表達(dá)量比較(±s)

注:與模型組比較:▲P＜0.05;與正常組比較:#P＜0.05

組別鼠數(shù)ACmRNAPDEmRNA正常組2011模型組200.58±0.06#1.33±0.07#黃精贊育膠囊組201.42±0.08▲#0.75±0.07▲#強(qiáng)精煎組202.40±0.46▲#0.53±0.06▲#

圖1 各組大鼠附睪AC、PDEmRNA相對表達(dá)量比較

3 結(jié)論

環(huán)核苷酸磷酸二酯酶超家族(cyclic nucleotidephosphodiesterases，PDEs)共有11位成員，作為不可或缺的環(huán)核苷酸信號(hào)調(diào)節(jié)器，參與大量的生理學(xué)過程。環(huán)核苷酸環(huán)化酶(AC和GC)合成環(huán)核苷酸，PDEs是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使cAMP和cGMP催化水解酶［6］，主要功能在于切割水解細(xì)胞內(nèi)的cAMP和(或)cGMP，導(dǎo)致其水平下降，繼而使其下游蛋白激酶G(PKG)活性減弱，從而調(diào)控各種生物學(xué)效應(yīng);發(fā)揮作用后的cAMP在磷酸二酯酶(PDE)的作用下轉(zhuǎn)化成5-AMP而失去功能。cGMP能夠促進(jìn)精子獲能以及頂體反應(yīng)，提高精子的活力，并且還能促進(jìn)精子新陳代謝，提高受精能力［7］，而PDE5能夠水解cGMP，可見PDE5表達(dá)的增加將會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)cGMP的濃度，進(jìn)而影響精子功能。因此，環(huán)核苷酸在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及PDEs在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平發(fā)揮作用，使其具有成為疾病治療靶點(diǎn)的潛力［8］。

腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)是廣泛利用的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的一個(gè)效應(yīng)分子，AC的產(chǎn)物cAMP在精子的獲能、運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)中有著重要的作用。Sinclair等［9］研究發(fā)現(xiàn)，sAC主要在精子、腎臟及脈絡(luò)叢中表達(dá)，這表明它與男性生育力有關(guān)，精子功能是通過cAMP介導(dǎo)的。Ca2+、HCO3-及sAC在受精過程中起重要的作用［10-11］，而sAC在精子內(nèi)有活性，它是保守的HCO3-、Ca2+傳感器［9］，調(diào)節(jié)精子的功能，最終激活精子的運(yùn)動(dòng)力和超激活運(yùn)動(dòng)，與雄性動(dòng)物的生育能力有關(guān)［3，12-13］。在精子獲能過程中，精子尾部質(zhì)膜發(fā)生改變，暴露或激活受體，進(jìn)一步刺激異源三聚體鳥苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)，激活Ca2+通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流進(jìn)入胞內(nèi)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)的cAMP濃度上升［14］。HCO3-直接作用于可溶性腺苷酸環(huán)化酶，引起cAMP濃度上升，激發(fā)cAMP-蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)，軸絲和纖毛鞘的蛋白磷酸化使鞭毛呈高度不對稱的快速鞭打運(yùn)動(dòng)，促使精子通過輸卵管黏稠介質(zhì)和穿越放射冠的彈性基質(zhì)，增強(qiáng)精子擺脫輸卵管上皮的能力，順利完成獲能［14］。一旦精子質(zhì)膜的組成、物理性質(zhì)或其他發(fā)生變化，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流或HCO-濃3度上升，激活sAC，隨之cAMP增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，使CatSper蛋白(精子陽離子通道蛋白)發(fā)生作用［12］。CatSper缺失的精子中，Ca2+內(nèi)流受阻，沒有足夠的Ca2+激活sAC，反饋調(diào)節(jié)中斷。由sAC合成的cAMP作用于鄰近的效應(yīng)目標(biāo)，包括離子通道、CatSper和蛋白激酶A(proteinkinase A，PKA)。sAC介導(dǎo)產(chǎn)生的cAMP激活PKA，使軸絲和纖毛鞘蛋白發(fā)生磷酸化，加速鞭毛鞭打。sAC缺失小鼠精子中的AC活性和cAMP水平急劇下降，HCO3-不能加速鞭毛鞭打或使Ca2+進(jìn)入sAC缺失的精子，進(jìn)而影響精子運(yùn)動(dòng)和受精;sAC基因的定向裂解不影響精子發(fā)生，但顯著破壞精子活動(dòng)力，導(dǎo)致男性不育;sAC缺失小鼠的精子前向運(yùn)動(dòng)能力大部分喪失，在體外不能使卵子受精［14］。國外研究［3］發(fā)現(xiàn)，sAC缺失的雄鼠只有30%的精子能夠繼續(xù)向前運(yùn)動(dòng)，剩余的精子呈卷曲狀。國內(nèi)亦有研究［2］表明，當(dāng)精子sAC的表達(dá)降低、PDE4C表達(dá)增加時(shí)，cAMP濃度降低，精子運(yùn)動(dòng)能力下降。

近年來，針對少弱精子癥藥物治療雖然有了一定進(jìn)展，但有明確療效的藥物仍不多見［15-16］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主生殖，腎精是生殖之精的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎的精氣有賴于脾胃運(yùn)化水谷精微的培育和充養(yǎng)。另外，脾為生血之源，精血可以互化，脾運(yùn)健旺，腎精得到脾化生的精微不斷補(bǔ)充才能保持盈滿，生殖之精也得以化生。因此，在少弱精子癥的病機(jī)上筆者強(qiáng)調(diào)以“脾腎兩虛”立論組方［4，17］。本方中重用枸杞子和黃芪，枸杞子味甘，歸肝、腎經(jīng)，補(bǔ)肝腎益精血;黃芪味甘微溫，益氣健脾，兼以利水，共為君藥;紫河車、菟絲子、鹿角霜、川斷味甘溫，補(bǔ)腎生精;黨參、當(dāng)歸味甘溫，助黃芪益氣養(yǎng)血生精，共為臣藥;益母草味苦微寒、活血清熱利濕，一物多用;五味子味酸甘溫，滋腎澀精;牡蠣味咸微寒，益腎收斂固精，與五味子一起兼防陽浮精越而妄泄，共為佐藥;神曲入脾、胃經(jīng)，消食助運(yùn)，以利受納為使藥。諸藥合用，溫而不燥，補(bǔ)而不膩，有補(bǔ)腎健脾、活血養(yǎng)血、清熱利濕作用，共奏生精強(qiáng)精之功。

本實(shí)驗(yàn)采用大劑量奧硝唑復(fù)制少弱精子癥大鼠模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測ACmRNA和PDEmRNA在附睪組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，強(qiáng)精煎組大鼠附睪精子ACmRNA表達(dá)水平明顯高于模型組，而PDEmRNA表達(dá)水平顯著低于模型組。表明中藥復(fù)方強(qiáng)精煎可通過上調(diào)附睪精子ACmRNA的表達(dá)，下調(diào)PDEmRNA表達(dá)來調(diào)節(jié)精子的功能，可能是其臨床改善精子活力、治療少弱精子癥的分子生物學(xué)機(jī)制之一，為中醫(yī)藥治療少弱精子癥提供了新的研究思路，值得進(jìn)一步深入探討。

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Effect of Qiang Jing Decoction on ACmRNA and PDEmRNA Expression of Oligoasthenozoospermia Rats

BIN Bin，LU Hai-wang，WANG Jie，WANG De-sheng，XU Jie-xin，QIN Zhi-biao，LIANG Jing-song，PANG Qiu-hua，CUI Jin-zhu

(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning Guangxi，530023，China)

Objective:To study the affects of Qiangjing decoction on the AC、PDE gene expression of testis epididymis in rat with oligoasthenospermia.Method:Randomly divide 80 adult SD rats into control group，model group，Qiangjing decoction group and HuangJingzanyu capsule group(n=20).Delivery method:control group:normal saline given daily; model group:ORN 800 mg/(kg·d);HuangJingzanyu capsule group:ORN 800 mg/(kg·d)+Huang Jingzan Yu capsule 400 mg/(kg·d);Qiangjing Decoction group:ORN 800 mg/(kg·d)+Qiangjing Decoction10 g/(kg·d).Four weeks after the administration，we take the testis and epididymis of the rats and measure the AC、PDE gene expression by using Realtime PCR.Result:In Qiangjing Decoction group，the level of PDE gene expression is significantly lower than the model group;while the level of AC gene expression is higher than the model group.Conclusion:Qiangjing Decoction can certainly decrease the level of PDE gene expression and increase the AC gene expression of rats with Ligoasthenozoospermia.This may be one of the mechanisms of Qiangjing Decoction healing the oligoasthenospermia.

Qiangjing decoction;Adenylate cyclase;Phosphodiesterase;Oligoasthenospermia

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0595-03

2015-02-22

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060297)-健脾益腎法對少弱精子癥大鼠的抗氧化作用及其調(diào)控機(jī)制的研究

賓彬(1964-)，男，廣西平南人，教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事男科學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)研究。

△通訊作者:陸海旺(1986-)，男(壯族)，廣西南寧人，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)男科疾病的臨床與研究，Tel: 15977462577，E-mail:haivang@163.com。